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人抗体Fab段天然抗体库建立 　 作者：韦晓明, 苏明权 杨安钢, 温伟红, 郝晓柯 【摘要】 目的: 提取健康人外周血淋巴细胞的mRNA, 利用反转录PCR方法, 建立一个大容量的人抗体Fab段的天然抗体库。方法: 收集健康者外周血, 提取淋巴细胞, 以淋巴细胞mRNA为模板, 扩增人抗体Fab段, 连入载体pComb3内, 利用电转化的方法, 构建噬菌体抗体库。结果: 最终建立了重链库为1.73×107, 轻链库为8.52×104的天然抗体库, 并利用酶切鉴定计算出实际库容为重链库1.21×107, 轻链库4.26×104, 所以理论上所建天然噬菌体抗体库总的库容量可以达到5.15×1011。结论: 成功构建了一个大容量的完全人源化的天然抗体库。 【关键词】 天然抗体库; Fab; 反转录PCR 自1975年单克隆抗体(mAb)问世以来［1］, mAb已广泛应用于临床疾病的诊断、 防治及基础理论研究等领域, 取得了令人鼓舞的结果。但鼠源性抗体用于人体防治会产生人抗鼠抗体（human antimouse antibody, HAMA）, 它不仅使治疗用mAb迅速失去效用, 而且会引起过敏反应。为此这些年来, 人们一直致力于鼠源mAb的人源化的工作。噬菌体抗体库是近十几年来发展的一种新的技术［2, 3］, 它使mAb的应用得到了进一步的推广, 而且被广泛应用于mAb人源化, 抗体亲和力提高等技术中。本研究中我们使用电转化的方法建立了大容量的人抗体Fab段天然抗体库, 从而为进一步的抗体人源化工作打下良好的基础。 1 材料和方法 1.1 材料 淋巴细胞分离液购自TBD生物技术中心; TRIzol reagent、 反转录试剂盒购自Promega公司; DEPC购自Sigma公司; 引物合成由大连宝生物公司合成; mRNA纯化试剂盒、 Taq DNA聚合酶购自Invitrogen; DNA凝胶纯化试剂盒购自上海华舜公司; 蛋白胨、 酵母提取物购自Oxoid公司; E.coli XL1Blue菌株为本室保存; 载体pCOMB3由杨洁硕士馈赠。LB（蛋白胨10 g/L、 酵母提取物5 g/L、 NaCl: 10 g/L, pH7.0）、 GYT（丙三醇100 mL/L、 酵母提取物1.25 g/L、 蛋白胨2.5 g/L, pH7.0）、 SOC（蛋白胨20 g/L、 酵母提取物5 g/L、 NaCl 0.5 g/L、 2.5 mmol/L KCl、 10 mmol/L MgCl2、 20 mmol/L 葡萄糖, pH7.0）等培养基为本室配置。PCR仪购自PE公司; 电泳仪购自BIORAD公司; 台式高速离心机购自上海安亭科学仪器厂; 高速冷冻离心机购自湖南仪表仪器总厂离心机厂; 紫外分光光度仪购自Beckman公司; BIORAD gene pulser II 电脉冲基因转移仪购自BIORAD公司。 引物设计［2］: Fd5′引物: 5′SAG GTG CAG CTC GAG SAG TCT GGG3′; 5′SAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG3′。Fd3′引物: 5′GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG3′; 5′CTC GAC ACT AGT TTT GCG CTC AAC TGT CTT 3′; 5′TGT GTG ACT AGT GTC ACC AAG TGG GGT TTT3′; 5′GCA TGA ACT AGT TGG GGG ACC ATA TTT GGA3′。κ链5′引物: 5′GAM ATY GAG CTC ACS CAG TCT CCA3′。κ链3′引物: 5′GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCA AG3′; 5′GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG ATC TCA G3′。λ链5′端引物: 5′CAS TYT GAG CTC ACK CAR CCG CCC TC3′。λ链3′端引物: 5′GAG GGA TCT AGA TTA TGA ACA TTC TGT AGG3′。 S=C or G; M=C or A; Y=C or T; K=G or T; R=A or G。 1.2 方法 1.2.1 淋巴细胞分离 2 300名志愿者（2003/2004年本院健康体检者）抽取外周血1 150 mL, 与淋巴细胞分离液以1∶1的比例混合,