三氧化二砷诱导肝癌细胞系HepG-2自噬及其机制探究.docVIP

三氧化二砷诱导肝癌细胞系HepG-2自噬及其机制探究 　 作者：朱传升　侯明　王金慎　王焱　徐文伟　董琳 【摘要】 　　目的：测定不同浓度三氧化二砷（As2O3）诱导前后HepG-2细胞自噬水平改变，并初步探讨机制。方法：常规细胞培养，按As2O3不同浓度分组；采用MDC染色，荧光显微镜观察自噬囊泡，流式细胞术检测其荧光强度；RT-PCR检测Bcl-2基因转录，免疫组织化学检测细胞Bcl-2蛋白阳性百分率，并分析同自噬的关系。结果：经不同浓度As2O3作用后，HepG-2细胞生长明显受到抑制；荧光显微镜可观察到自噬囊泡的出现；Bcl-2基因表达降低；经相关性分析，HL-60细胞自噬水平与Bcl-2基因表达呈负相关。结论：As2O3可诱导HepG-2细胞自噬，v诱导HepG-2细胞自噬的机制可能与下调Bcl-2基因表达有关，自噬和凋亡存在交叉。 【关键词】 自噬　基因，Bcl-2　三氧化二砷　肝肿瘤　细胞　 培养的 　　Study of HepG-2 cells autophagy induced by arsenic trioxide and its mechanism 【ABSTRACT】 Objective: To assess the level of autophagy and its mechanism in HepG-2 cells after induction with arsenic trioxide. Methods: The autophagy was analyzed using fluorescent microscope and flow cytometry by monodansylcadaverin（MDC） staining. RT-PCR was used to examine the Bcl-2 mRNA expression. APAAP was used to detect Bcl-2 protein positive percentage and its correlation with autophagy level was analyzed. Results: HL-60 cells＇ growth was obviously inhibited after induction with different density arsenic trioxide; autophagy vesica was observed using fluorescent microscope; Bcl-2 gene expression was inhibited; cells autophagy level was negative correlated with Bcl-2 gene expression. Conclusion: Arsenic trioxide may induce HpG-2 cells to autophagia and its main mechanism was to down-regulate bcl-2 gene expression. 【KEY WORDS】 Autophagy· Gene，Bcl-2·Arsenic trioxide·Liver neoplasms·Cells, cultured 　　三氧化二砷（As2O3）作为一种抗肿瘤药物，主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡。关于As2O3是否可诱导肿瘤细胞发生非凋亡形式的死亡（如自噬等），国内外报道较少。本研究通过观察不同浓度As2O3作用HepG-2细胞前后自噬水平的变化，初步探讨了其发生机制，总结报道如下。 1　材料与方法 1.1　主要试剂　单丹磺酰尸胺（MDC，货号30432）为美国sigma公司产品，临用前用PBS配制成0.05 mmol/L；As2O3 1 g/L（哈尔滨伊达药业产品），用前RPMI 1640稀释成所需浓度；RT-PCR所用TapDNA聚合酶、dNTPs、RNA酶抑制剂等购自上海志壮生物有限公司；目的引物参照文献说明，由上海生工合成。免疫组化试剂盒、鼠抗人Bcl-2单抗、羊抗小鼠lgG二抗均购自北京中杉金桥生物有限公司。 1.2　细胞培养及分组　肝癌细胞株HepG-2由山东省千佛山医院普外科中心实验室传代培养。实验细胞以2×105 ml-1 接种于培养瓶中，培养液为10%胎牛血清的RPMI 1640，置37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱，行细胞爬片生长。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度As2O3处理。按As2O3浓度不同分为 0 （对照组）、1.0、 2.0、 4.0 和 8.0 μmol/L 5组；各组于处理24 h后用0.25% 胰蛋白酶消化，收获细胞或取出细胞爬片