DcR3对人肺成纤维细胞合成Ⅳ型胶原作用.docVIP

DcR3对人肺成纤维细胞合成Ⅳ型胶原作用 　 作者：杨洋, 乔俊华, 安继红, 张越, 吴春风, 郏博, 马忠森 【摘要】 目的: 探讨诱骗受体3（DcR3）对人肺成纤维细胞（HLF）合成Ⅳ型胶原的作用。方法: OverPCR方法构建DcR3的真核表达载体, 脂质体法转染HLF细胞, Western blot检测HLF细胞合成Ⅳ型胶原的含量。结果: 成功构建了pvax1DcR3真核表达载体并转染HLF细胞; 转染组细胞Col Ⅳ表达量明显升高, 从12 h开始持续到72 h, 与对照组比较差异有统计学意义（Plt;0.01）; 而转染+抗体组与对照组比较差异无统计学意义（Pgt;0.05）; 转染组不同时间Col Ⅳ表达量有统计学意义（F=34.25, Plt;0.05）。结论: DcR3促进HLF细胞合成Ⅳ型胶原的能力, 可能是加速肺纤维形成的因素之一。 【关键词】 DcR3基因; HLF; Ⅳ型胶原 诱骗受体3 (decoy receptor 3, DcR3)是一个新发现的具有免疫抑制作用的分子, 与多种自身免疫性疾病、 肿瘤、 弥漫性肺间质疾病等相关［ 1, 2 ］。有文献报道DcR3在肺纤维化患者外周血单核细胞中高度表达［3］, 但是DcR3在肺纤维化的发病过程中, 到底扮演怎样的角色, 目前尚不明确。本研究拟通过检测分析转染DcR3后, 肺成纤维细胞合成Ⅳ型胶原的能力, 探讨DcR3对肺纤维化形成的作用。 1 材料和方法 1.1 材料 人肺成纤维细胞（human lung fibroblast, HLF）购自上海细胞研究所。真核表达质粒pvax1购自天根公司; 原核表达质粒pET28a（+）DCR3（含酶切位点BamH I和EcoR I）, 为本室构建并保存。Mouse anti human DcR3自备。小鼠抗人Col Ⅳ单克隆抗体(mAb)和相应二抗及DAB显色液购自武汉博士德生物试剂公司。PCR引物、 Primer STARTM HS DNA Polymerase、 DH5αE.coli感受态细胞、 DNA 连接酶、 限制性内切酶BamH I和EcoR I、 核酸分子质量标准、 购自天根公司; LipofectamineTM2000脂质体、 细胞培养试剂购自Invitregen公司; 质粒抽提试剂盒购自美国Promega公司; PVDF膜购自Roche公司, RPMI1640 培养基细胞培养试剂购自Sigma 公司。 1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成 参考GenBank 收录的DcR3序列和信号肽序列（AF104419）, 设计引物如下: A1: 5′CGGATCCAGCATGGCCCTGTGGATGCGCC3′（斜体为BamH I酶切位点）; A2: 5′CAGGGGTAGGTGGGTGTTTCTGCCACGGCTGCGGCTGGGTCAGGTC3′; B1: 5′GACCTGACCCAGCCGCAGCCGTGGCAGAAACACCCACCTACCCCTG3′; B2: 5′CCGAATTCTCAGTGCACAGGGAGGAAGCG3′（斜体为EcoR I酶切位点）上述引物由上海生工生物工程公司合成并纯化。 1.2.2 PCR 扩增人DcR3cDNA 通过overlap PCR方法将信号肽和目的基因相连, 扩增出完整的DcR3cDNA。具体如下: 以含信号肽质粒为模板, 以A1、 A2为引物扩增信号肽序列; 以含目的基因质粒为模板, 以B1、 B2为引物扩增目的基因; 以1和2步骤中产物为模板, 以A1和B2为引物扩增即得到含信号肽的目的基因序列。循环条件为: 94℃ 45 s, 63℃ 90 s, 72℃ 1 min, 共进行35个循环, 最后一个循环72℃延伸10 min。 1.2.3 DcR3重组质粒的构建和鉴定 TaKaRa 胶回收试剂盒回收PCR 产物。提取质粒载体pvax1, 然后用BamH I和EcoR I对质粒和纯化后的PCR产物分别进行双酶切。酶切产物用TaKaRa胶回收试剂盒回收, 紫外分光光度计上测定载体和PCR两种双酶切产物量。然后按10∶1 (DcR3∶pvax1)的摩尔比混合, 16℃连接反应过夜。将连接产物转化感受态DH5α, 氨苄平板筛选。取阳性单克隆进行扩增, 抽提重组pvax1DcR3质粒进行BamH I和EcoR I双酶切, 然后在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳鉴定目的片段是否插入。鉴定正确的克隆送上海生工生物公司测序。 1.2.4 HLF细胞培养 HLF细胞培养采用100 mL/L FCS培养液和条件培养液联合培养（1∶1）。条件培养液制备: 取5只2