DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中表达水平检测.docVIP

DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中表达水平检测 　 作者：胜利, 安利峰, 史霖, 范桂香, 袁育康 【关键词】 DcR3; 结肠癌; 表达 诱骗受体3(decoy receptor 3, DcR3)是新近发现的一种可溶性的肿瘤坏死因子受体（tumour necrosis factor receptor, TNFR）家族成员［1］。研究表明它在某些肿瘤、 自身免疫病等疾病中高度表达, 其蛋白的表达和基因的扩增与人类多种恶性肿瘤的发生、 发展以及肿瘤的免疫逃逸密切相关［2］。故我们研究DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中的表达, 阐明其与结肠癌的相关性。 1 材料和方法 1.1 标本来源 2004-05/2005-12在西安交通大学医学院第一附属医院就诊, 经病理学确诊的结肠癌患者44例, 男25例, 女19例, 年龄27～78岁, 平均52岁。经病理学确诊的其他消化道肿瘤患者20例, 男12例, 女8例, 年龄34～72岁, 平均48岁。健康对照组30例, 男18例, 女12例, 年龄28～65岁, 平均46岁。癌组织石蜡包埋组织26例。其中结肠癌患者17例, 其他消化道肿瘤患者9例。 1.2 主要仪器和试剂 TMSF倒置显微镜为日本尼康产品; 7700型荧光定量PCR仪为美国PE公司产品; TannonGIS型全自动凝胶成像分析系统购自上海Tannon公司; 细胞总RNA TRIzol提取液及DNTPs购自Promega公司; cDNA第一链合成试剂盒为美国Fermentas产品; Taq DNA聚合酶购自晶美生物公司; 引物由大连宝生物生物工程公司合成; DcR3单克隆抗体（mAb）由汤南博士惠赠; S100蛋白和SP试剂盒均购自北京鼎国生物公司。 1.3 方法 1.3.1 外周血单核细胞分离 每个实验对象抽取5 mL静脉血, 肝素抗凝, 用常规密度梯度离心法分离外周血单个核细胞, 用预冷的生理盐水洗3遍后, 迅速放入-70℃冰箱冻存备用。 1.3.2 RTPCR 检测DcR3mRNA的表达水平 用细胞总RNA TRIzol提取液提取总RNA, PCR扩增, PCR产物经15 g/L的普通琼脂糖凝胶电泳后, 溴化乙啶染色, 通过TannonGIS影像分析仪进行DNA条带和强度分析, 把DcR3和βactin的比值作为DcR3基因的相对表达水平进行比较。 1.3.3 免疫组化检测DcR3蛋白的表达水平 免疫组化染色SP法, 按说明书进行操作。 1.3.4 统计学分析 DcR3基因相对表达水平数据以x±s表示, 采用组间配对t检验。 2 结果 2.1 DcR3mRNA水平的检测 结果显示, 结肠癌患者、 其他消化道肿瘤患者和健康人外周血单核细胞中均检测到DcR3基因的表达。PCR产物电泳后在144 bp大小位置均见有一清亮条带, 与预计的DcR3基因片段大小一致, 同时在660 bp大小位置也显示有清亮条带, 此为内参照基因βactin片段产物（图1）。DNA条带和强度分析显示, 结肠癌患者外周血单核细胞DcR3基因呈过度表达, 其相对表达水平为0.421±0.075, 而其他消化道肿瘤患者和健康人外周血单核细胞中DcR3基因有低水平的表达, 其相对表达水平分别为0.248±0.076和0.235±0.074（图2）。结肠癌患者与其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3基因表达水平相比有差异(Plt;0.05), 而其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3基因表达水平相比则无统计学意义(Pgt;0.05)。 2.2 DcR3蛋白表达水平的检测 DcR3定位于细胞质和癌巢周围间质细胞, 以至少有20%的肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞, 400倍光镜下随机选取5个视野计数, 判断DcR3阳性表达率。结果显示, 17例结肠癌组织中有13例 (76.47%)阳性表达, 而9例其他消化道肿瘤组织中仅有1例(11.11%)阳性表达, 正常结肠组织均无表达（图3）。结肠癌患者与其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3蛋白表达水平相比有统计学意义(Plt;0.05), 而其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3蛋白表达水平相比则无统计学意义(Pgt;0.05)。 　 3 讨论 本研究对经病理学确诊的结肠癌患者44例、 其他消化道肿瘤患者20例、 健康对照组30例, 采用RTPCR法检测了外周血中的DcR3 mRNA表达水平; 对经病理学确诊的结肠癌患者17例、 其他消化道肿瘤患者9例和5例正常结肠组织做免疫组化, 检测了DcR3蛋白表达水平。发现结肠癌患者血中DcR3 mRNA及癌组织中DcR3蛋白表达明显高于正常人和其他消化道肿瘤患