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CD32在人肝癌细胞株上表达 　 作者：李和军 刘宁 李频 郑祥雄 【摘要】 目的 检测CD32在人肝癌细胞株SMMC7721、BEL7404 、HepG2上的表达，探索其在肿瘤免疫治疗中的应用价值。方法 分别应用RTPCR方法、流式细胞术检测3种肝癌细胞株上CD32的表达情况，以u937为阳性对照。结果 u937高表达CD32，而肝癌细胞株SMMC7721、BEL7404 、HepG2未检测到CD32的表达。结论 肝癌细胞株SMMC7721、BEL7404 、HepG2不表达CD32，应用基因工程方法调节肿瘤细胞上不同亚型CD32的表达,或许可以激发机体抗肿瘤免疫，成为肿瘤免疫治疗的新途径。 【关键词】 CD32;肝癌细胞;肿瘤免疫治疗 CD32是免疫球蛋白IgG受体FcγR中的一种，已有研究表明CD32与肿瘤的发生、发展密切相关，因此调节CD32等FcγR的表达，或许可以成为治疗肿瘤的一条新途径。目前对于肿瘤细胞上CD32表达情况知之甚少，本文利用RTPCR方法及流式细胞术检测肿瘤细胞CD32的表达，为下一步探讨CD32在肿瘤发生发展中的作用及研究治疗肿瘤的新途径奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 胰酶、RPMI1640 和Trizol试剂为GibcoBRL公司产品。胎牛血清为杭州四季青生物技术公司产品。逆转录酶、Taq DNA聚合酶为Promega公司产品。FITC标记的鼠抗人CD32单克隆抗体(mAb)购自深圳晶美公司。人肝癌细胞株SMMC7721、BEL7404、HepG2由本院肝胆研究所馈赠，髓系白血病细胞株u937由本院血液病研究所惠赠。 　　1.2 RNA的提取及RTPCR检测CD32片段 引物序列由上海生物工程有限公司合成。上游：5′AAAGGCTGTGCTGAAACTCG3′;下游：5′TGCTTGTGGGATGGAGAAGT3′，PCR产物为400 bp。各细胞株在含200 ml/L胎牛血清的RPMI1640环境中培养36 h。收获细胞,用Trizol试剂提取总RNA，以RTPCR扩增目的基因片段，PCR条件为：94℃变性60 s，55℃退火60 s，74℃延伸60 s，共循环30次。PCR产物在15 g/L琼脂糖凝胶中电泳后观察结果。 　　1.3 流式细胞术检测细胞膜表面CD32的表达 用PBA稀释的PE荧光标记小鼠抗人CD32抗体200 μl重悬细胞，4℃静置孵育30 min，离心洗涤后用冷PBS 200 μl重悬细胞，上机检测;以PE标记的小鼠抗人IgG为阴性对照，以u937为阳性对照。 　　2 结 果 　　2.1 RTPCR检测CD32片段 应用RTPCR法扩增CD32膜外段基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，u937细胞株可扩增出1条特异性条带，与预测的结果一致;而肝癌细胞株SMMC7721、BEL7404、HepG2均未检测到预期的特异性条带。见图1。 　　1.GeneRulerTM 100 bp DNA Marker;2.阴性对照组;3.u937组;4.SMMC7721组;5.BEL7404组;6.HepG2组 　　图1 RTPCR法检测人肝癌细胞株CD32的表达 　　2.2 流式细胞术检测肝癌细胞株CD32的表达 流式细胞术检测显示，u937高表达CD32，表达率为99.6%;而肝癌细胞株SMMC7721(表达率2.94%)、BEL7404(表达率0.98%)、HepG2(表达率0.84%)细胞膜上未检测到CD32的表达。 　　　3 讨 论 　　免疫球蛋白IgG受体FcγR包括CD16、CD32、CD64，属Ig超家族。CD32即FcγR Ⅱ，是人IgG Fc低亲和力受体，主要表达于单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、朗罕细胞、B细胞、血小板和胎盘内皮细胞等表面，在介导炎症介质的释放、ADCC、抗原提呈、吞噬或吞饮中发挥作用〔1〕。已证实CD32分为CD32A、CD32B、CD32C 3个亚型，各型之间的主要差别在于胞内区结构不同。其中CD32A为活化型受体，胞内区域包含酪氨酸受体活化基序(ITAM)，与免疫复合物结合后导致酪氨酸磷酸化，激活细胞;而CD32B为抑制性受体，胞内区域包含酪氨酸受体抑制基序(ITIM)〔2〕，与免疫复合物结合后引发基于ITIM信号的级联反应，抑制细胞的活化，甚至诱发细胞的凋亡，两者可共存于同一细胞表面，维持正常的生理平衡，与肿瘤、自身免疫性疾病的发生、发展及治疗相关。既往研究表明，随着B细胞发育成熟，CD32表达逐渐增加，成熟B细胞主要表达CD32B，其与BCR(B细胞抗原受体)交联后，能够抑制BCR诱发的细胞活化，起负性调节作用。而急性B淋巴细胞白血病的幼稚B细胞则主要表达CD32A，