脓汁和粪便标本中原菌的检测-5.pptVIP

医学微生物学实验综合性实验一 脓汁和粪便标本中病原菌的检测（五） 糖发酵试验 药敏试验 血浆凝固酶试验 半固体接种法 糖发酵试验Sugar Fermentation Test 不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的代谢产物也各不相同，有的产酸，有的产酸又产气，据此，可以鉴别各种细菌。 糖发酵管:葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖等。 指示剂：溴甲酚紫，PH≥6.8为紫色，≤5.2为黄色。 原理：多糖→单糖→丙酮酸、酸性产物(产气)→ pH↓→指示剂呈酸性变色。 结果:培养基变色无气泡“+” ，培养基变色有气泡“⊕”，培养基不变色“-”。 应用:观察细菌对糖的分解情况,常用于肠道杆菌鉴定。 实验分组 俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。 抗菌素敏感性试验Antibiotic Susceptibility Test 磺胺1907年发现，1935年临床应用。青霉素1929年发现，1945年临床应用。 我国住院病人抗菌素使用率达70%，新生儿病房抗菌素使用率达100%。 为了避免抗菌药物使用的盲目性，防止因不合理用药，导致耐药性细菌的增多、药物中毒、治疗失败、菌群失调等问题的发生，用药前（时），做药物敏感性试验。 抗菌素敏感性试验分工 甲→黄色菌液→平板 + 青、链、庆纸片。 乙→白色菌液→平板 + 青、链、庆纸片。 丙→紫黑菌液→平板 + 青、链、庆纸片。 丁→粉红菌液→平板 + 青、链、庆纸片。 ※每人1个营养琼脂平板 抗菌素敏感性试验方法 接种环取菌液3～5ul×2环,在平板培养基表面，拉出2条细菌接种线，使呈“十字形”(注意：操作时，不得同时握持菌液管和平板，以免菌液倒出来，造成污染） 平板密集划线接种细菌（纱窗样）。 设计三点，呈等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。 作标记：青、链、庆。 镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，镊子火焰灭菌。 37℃18～24小时培养，观察结果。 ※试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密集为宜。 凝固酶试验 Coagulase Test 致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白,附着于细菌表面,产生凝固。 葡萄球菌产生两种凝固酶:一种是与细胞壁结合的凝固酶,为结合凝固酶;另一种是细胞释放于培养基中,为游离凝固酶；二者抗原性不同。 在体内，凝固的血浆沉积在菌体表面，阻碍吞噬细胞的吞噬和杀菌物质的破坏，从而有利于细菌的生长繁殖、引起感染。 体外试验有试管法和玻片法两种。 试管法检测游离凝固酶，结果准确。 玻片法只能检测结合凝固酶，比较简便，常作为快速筛选技术（金黄色葡萄球菌中有10%～15%可呈阴性反应）。 凝固酶试验玻片法 取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。 分别用接种环取白色和黄色菌苔(2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合，立即观察结果。 菌液出现明显凝块为阳性，否则为阴性。 ※白色菌苔容易混合均匀，黄色菌苔常涂抹不开。 ※反复旋转或侧倾载玻片，让菌液流动起来，结果更明显。 生物安全警告 本次实验（糖发酵试验、药敏试验、血浆凝固酶试验和半固体接种）操作，可能产生几百个微生物气溶胶颗粒。 气溶胶粒径＞100um沉降很快,＜50um在0.4s内扩散开,＜5um通过呼吸道直接到达肺泡。 Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。 实验时应坐着，在火焰周围10～20厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。 思考题 细菌生化反应在感染性疾病诊断中有何重要意义? 为什么要在发酵管液面上方大约2～3cm处切割？ 培养时，微量糖发酵管管口不能朝上，为什么？ 抗生素敏感性实验有何实际意义? 血浆凝固酶试验观察完毕，应将载玻片立即放入消毒缸内，为什么? 半固体穿刺接种时，为什么要强调“原路返回”? 为保证实验结果的可靠性，你认为上述试验应还设立哪些对照? * * 器材准备 斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支， 营养琼脂平板4个，微量发酵管1套，青链庆纸片1套，眼科镊子2把。 甲→紫黑→①葡萄糖 乙→紫黑→②乳糖 丙→粉红→③葡萄糖 丁→粉红→④乳糖 2-3cm 37℃ 24小时 细菌的糖发酵试验 甲 乙 4 丙 丁 甲 乙 3 丙 丁 甲 乙 2 丙 丁 甲 乙 1 丙 丁 甲 乙 5 丙 丁 甲 乙 8 丙 丁 甲 乙 7 丙 丁 甲