毕赤酵母工程菌表达乙肝表面抗原结合蛋白SBP的发酵-生物通.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（１２）：５９６８ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 技术与方法 檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 毕赤酵母工程菌表达乙肝表面抗原结合蛋白（ＳＢＰ） 的发酵纯化工艺研究 董　越　苏彩霞　杨　艳　朱乃硕 （复旦大学 生命科学学院及生物医学研究院　遗传工程国家重点实验室　上海　２００４３３） 摘要　乙肝表面抗原结合蛋白（ＨＢｓＡｇｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＢＰ）是以ＨＢｓＡｇ为探针，通过人肝ｃＤＮＡ 噬菌体表达库筛选的一种人源蛋白。ＳＢＰ可特异性结合乙肝表面抗原（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＢｓＡｇ），增强乙肝疫苗的免疫效果，是一种潜在快速高效的免疫佐剂。成功构建了分泌 型高表达ＳＢＰ的毕赤酵母工程菌。对该菌株进行了放大规模发酵表达，并对纯化工艺进行了研 究。在发酵实时检测过程中，自诱导剂甲醇加入开始，ＳＢＰ蛋白的分泌表达量随时间推移而逐渐 增加，发现于３８ｈ达到最佳水平且此时杂蛋白含量最少，是放罐收集菌液的最佳时间。１８Ｌ发酵 液在低温离心除菌体和沉淀物后可得到１５Ｌ的上清液，再利用截留量为５ｋＤａ的超滤膜包将上清 液浓缩至２Ｌ，将浓缩后的上清液依次通过Ｓ２００分子筛柱和ＴＤＥＡＥ阴离子交换柱进行分离纯化， 可得到３００ｍｌ浓度为１．１２５ｍｇ／ｍｌ、纯度达９８％的目标蛋白液，发酵液得率为２２．５ｍｇ／Ｌ；最后将蛋 白液定量分装冻干低温保存。所获得的放大规模ＳＢＰ发酵诱导表达条件和ＳＢＰ蛋白的分离纯化 工艺，为ＳＢＰ蛋白大规模生产奠定了坚实的基础。 关键词　乙肝表面抗原结合蛋白　毕赤酵母　发酵　纯化工艺 中图分类号　Ｑ８１９ 　　乙型病毒性肝炎是世界范围内流行的一种严重危 疫苗的免疫原性中起着重要的作用，但多数佐剂因其 害人类健康的传染性疾病，具有强的发病率和致死率。 效率低、安全性差而不能得到广泛应用。 我国更是乙肝高发区，约有 １．２亿人是病毒携带者。 　　在前期工作中，本课题组以乙肝表面抗原为探针， 目前并没有治疗乙肝病毒的特效药，因此预防感染乙 从人肝ｃＤＮＡ噬菌体表达库中筛选出一种新型的人源 型肝炎和降低乙型肝炎病毒携带率的最有效措施是接 性蛋白———乙肝表面抗原结合蛋白（ＨＢｓＡｇｂｉｎｄｉｎｇ ［１］ 种乙肝疫苗。但现有的乙肝疫苗的免疫次数多、周期 ｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＢＰ） 。ＳＢＰ蛋白属于免疫球蛋白超家族成 长且免疫的个体差异大，正常人群中有５％～１０％的个 员，由３４４个氨基酸组成，分子量是３７ｋＤａ，等电点为 体在按标准程序接种乙肝疫苗后不能产生足够的抗体 ８．０。ＳＢＰ能够特异性结合ＨＢｓＡｇ并显著提高现有乙肝 ［２３］ 以抵抗乙肝病毒的感染。因此，提高疫苗免疫能力，缩 疫苗接种后的特异性抗体产生量 ，提示ＳＢＰ可开发 短接种周期成为迫在眉睫的问题。而佐剂在增强乙肝 为新型高效快速的免疫增效剂，进而在乙肝防治中发 挥重要作用。 收稿日期：２０１４０９０２　　修回日期：２０１４１０１６ 国家 自然科学基金 （５Ｎ１３６７４６３０９７０１４４）、国家 　　本实验室已成功构建了一株分泌型高表达ＳＢＰ且 “８６３”计划重大课题（２０１１ＡＡ０２Ａ１１４）、上海市科委科技支撑项目 ［４５］