三杆状病毒介导的相关病毒载体的生产1.pdf

中国科技论文在线 三杆状病毒介导的腺相关病毒载体的生产1 1 2 1,2 * 雷求刚 ，徐增辉 ，钱其军 1 浙江理工大学生命科学学院，杭州(310018) 2 第二军医大学东方肝胆外科医院，上海(200438) E-mail: lqg127@ 摘 要：由于腺相关病毒(Adeno-associated Viruses, AAV)的非致病性及能感染多种组织类 型，重组AAV 载体（rAAV ）在基因治疗领域备受关注。然而，如何有效生产rAAV 以适 应临床上对其高产量的需求一直是个较大的瓶颈。借助杆状病毒携带rAAV 包装所需组分， 通过感染昆虫细胞来生产rAAV 是一种能够解决其产量瓶颈的生产方式。将AAV2 的Rep 、 Cap 基因序列以及含AAV2 ITR 及EGFP 表达框的序列分别构建到三个杆状病毒中，通过共 感染Sf9 细胞来生产rAAV ，结果显示成功包装出rAAV 病毒，且病毒活力较好。这种生产 方式很容易放大，将为AAV 载体产业化及临床应用奠定重要基础。 关键词：rAAV ；杆状病毒；病毒生产 1. 引 言 腺相关病毒（Adeno-associated Virus, AAV ）是细小病毒(parvovirus)家族中依赖病毒属 （Dependovirus ）中的一员，最早于1965 年作为腺病毒制备物中的一种污染成分被发现[1]， 其复制性感染需要在腺病毒或单纯疱疹病毒的辅助下才能发生。AAV2 基因组为单链线性 DNA ，大小为4.7kb 左右，包含2 个开放阅读框(ORFs)，左边Rep ORF 的四个产物Rep78 、 Rep68 、Rep52 和Rep40 主要负责病毒的位点特异性整合、复制和转录调控等；右边Cap ORF 的三个产物VP1, VP2 和VP3 主要负责病毒颗粒的装配，构成AAV 的外壳并将AAV 单链 DNA 基因组包裹在壳内形成成熟的 AAV 病毒颗[2][3] 。AAV 基因组的两端各有一个 145bp 的末端重复序列(ITR)，其中靠近末端的 125 个碱基是一个较长的回文结构，自身能通过碱 基互补配对进行折叠，使得ITR 呈现出T 字型的发卡结构，是AAV 复制和包装所需的唯一 顺式作用元件[4] 。 rAAV 只保留了两端的ITR 序列，AAV 的Rep 及Cap 基因由外源基因表达框替代。在 生产rAAV 时，只要提供Rep 和Cap 蛋白的反式功能以及其它辅助病毒的辅助功能，带有 外源基因的重组AAV 基因组就会被营救、复制并包装成rAAV 病毒[5] 。然而，临床上对AAV 载体的产量要求是比较高的，难以获得一种简单、易放大、安全性较好的高产量生产方式是 阻碍其应用于基因治疗的一个重大瓶颈。由于杆状病毒不像腺病毒和单纯疱疹病毒那样会对 人体产生毒性，最近基于杆状病毒- 昆虫细胞的rAAV 生产系统引起了广泛关注。杆状病毒- 昆虫细胞生产系统需要以下两类反式组分：两个复制蛋白Rep78、Rep52 以及三个外壳蛋白 VP1 、VP2 、VP3 。Urabe 等[6]首次采用三个杆状病毒感染昆虫细胞来探索rAAV 的生产，单 个细胞的产量达到5×104 个rAAV ，且性质与传统的哺乳动物细胞产生的rAAV 没有区别。 我们在Urabe 等人研究结果的基础上，合理改进杆状病毒载体，将Rep78 与Rep52 分开， 分别与其它的Cap 基因组合，这样避免了由于Rep78 与Rep52 的同源性造成重组杆状病毒 的不稳定。在构建三个杆状病毒 Bac-AAV2Rep78Cap2+3, Bac-AAV2Rep52Cap1 和 Bac-AAV2EGFP 后，通过共感染Sf9 昆虫细胞来生产带EGFP 的重组AAV 。 1本课题得到国家自然科学基金(No的资助。 -1- 中国科技论文在线