去垢剂对单向免疫扩散法测定流感病毒疫苗血凝素含量影响.docVIP

去垢剂对单向免疫扩散法测定流感病毒疫苗血凝素含量影响 　去垢剂对单向免疫扩散法测定流感病毒疫苗血凝素含量的影响 论文代写 流感病毒的囊膜外层分布着两种主要的抗原物质：血凝素（haemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）[1-2]。研究表明，血凝素在流感病毒感染宿主细胞的过程中起着至关重要的作用[3]，是流感病毒亚单位疫苗中有效的免疫物质[4-6]。因此，血凝素含量的准确测定是流感病毒疫苗制品质量控制的关键。目前，国际上通用的流感论文联盟病毒血凝素含量测定方法是单向免疫扩散法（single radial immunodiffusion，SRID）[7-12]，该方法不仅应用于流感病毒亚单位疫苗成品的血凝素含量测定，在疫苗制品生产的中间过程控制中也起着至关重要的指导作用。 　在流感病毒亚单位疫苗的生产过程中，首先制备出大量的完整病毒，然后经裂解、纯化等若干处理后获得亚单位疫苗[13]。为了在疫苗制品的生产过程中对不同阶段的中间产品进行必要的质量控制，就需要对不同组成成分的中间产品进行血凝素含量的检测。这些中间产品既包括未裂解的完整病毒也包括经过裂解、纯化的亚单位产品。因此，确定一种能够同时对完整病毒和亚单位疫苗进行血凝素含量测定的单向免疫扩散法对于疫苗生产过程的质量控制具有重要的意义。 　1 材料与方法 　1.1 疫苗中间产品和标准抗原/抗血清 　流感病毒疫苗中间产品：完整病毒液及亚单位疫苗原液由天士力金纳生物技术（天津）有限公司生产；标准抗原/抗血清均购自NIBSC。 　1.2 主要试剂 　琼脂糖（BIOWEST）；去垢剂：Zwittergent 3-14 Detergent（Merck）；染色液（0.4%考马斯亮蓝R250）；脱色液（无水乙醇∶冰醋酸∶水=29∶12∶59）。 　1.3 抗原样本的处理 　1.3.1 去垢剂浓度的比较 将A/Victoria/210/09（H3N2）（NYMCX-187）标准抗原、完整病毒液1、亚单位疫苗原液1三个抗原样本以抗原：去垢剂=9∶1的体积比分别加入浓度为0.375%、0.625%、1.25%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%（w/v）的去垢剂，以PBS代替去垢剂等体积加入，作为去垢剂浓度为0的对照。3组抗原样本各经八个浓度（终浓度分别为0、0.037 5%、0.062 5%、0.125 0%、0.250 0%、0.500 0%、1.000 0%、2.000 0%）的去垢剂在室温下裂解30 min后同时加至抗体凝胶板中进行SRID。 　　1.3.2 裂解时间的比较 取A/Victoria/210/09 （H3N2）（NYMCX-187）标准抗原和亚单位疫苗原液2，分别加入1/9体积的10%（w/v）去垢剂，在室温条件下分别放置不同时间进行裂解。其中，各裂解时间组的标准抗原均稀释为1、0.75、0.50、0.25倍浓度，完整病毒液2和亚单位疫苗原液2分别稀释12倍和15倍后进行裂解。所有抗原样本经处理后同时加至抗体凝胶板中进行SRID。 　1.4 SRID实验 　用PBS配制1%琼脂糖溶液，加热融化后降温至45℃，按说明书中的建议量加入标准抗血清，混匀后倾注在扩散板上（凝胶厚度为2 mm），待琼脂糖溶液凝固后用4 mm直径的打孔器打孔并除去孔内凝胶，即为抗体凝胶板。 　向抗体凝胶板的各加样孔中分别加入18 mu;L处理后的抗原样本，将凝胶板置于湿盒内室温扩散至少18 h。凝胶经漂洗、压薄、干燥后进行染色、脱色，测量沉淀圈直径[8]。 　2 结果 　2.1 去垢剂浓度的比较 　将标准抗原、完整病毒液1、亚单位疫苗原液1三个抗原样本分别以终浓度为0、0.037 5%、0.062 5%、0.125 0%、0.250 0%、0.500 0%、1.000 0%、2.000 0%的去垢剂于室温下同时裂解30 min后进行SRID，测量沉淀圈直径，然后根据三组样本的沉淀圈直径绘图，见图1。 论文代写 　从3条曲线的形态可以看出，去垢剂终浓度由0增加至0.125%时，3种抗原的沉淀圈均逐渐增大；当去垢剂浓度由0.125%增至2.00%时，标准抗原和亚单位疫苗的沉淀圈直径无明显变化，而完整病毒的沉淀圈仍随去垢剂浓度的增大而变大，直到去垢剂终浓度达到1%时，才不再增大。这说明不论是标准抗原、亚单位疫苗还是完整病毒，在进行SRID实验前都需要进行裂解；标准抗原和亚单位疫苗因为事先都经过了一定的裂解过程，故需要的去垢剂浓度较低（0.125%），而完整病毒则需要使用较高浓度（1%）的去垢剂才能够充分裂解。 　图1中亚单位疫苗与标准抗原两条曲线几乎是平行的，这说明去垢剂浓度的变化对该亚单位疫苗与标准抗原的影响是一致的。经过终浓度不小于0.12