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利用siRNA抑制人骨肉瘤细胞survivin表达 　 作者：李鲲，杨述华，刘红云，傅德皓，宁旭，梅荣成 【摘要】 目的 构建生存素（survivin）短发夹状RNA表达载体，检测其对骨肉瘤细胞survivin mRNA及蛋白表达的影响。方法 体外构建survivin shRNA 表达载体pSilence2.1neosurvivin,转染骨肉瘤细胞系MG63，RTPCR、免疫组化方法检测转染前后survivin mRNA及蛋白的表达，MTT比色法检测细胞增殖活性。结果 pSilence2.1neo survivin载体转染能显著抑制survivin mRNA、蛋白表达，转染后48h细胞增殖的抑制率为61.83%。结论 pSilence2.1neosurvivin可显著抑制MG63细胞survivin mRNA、蛋白的表达及细胞的增殖活性。 【关键词】 survivin；RNA干扰；短发夹RNA；骨肉瘤 Inhibition of the Expression of survivin in Osteosarcoma Cell by A Short Hairpin RNA Key words：survivin；RNA interference；Short hairpin RNA；Osteosarcoma RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是一种新兴的转录后基因阻断技术, 可以简单、有效、特异地下调细胞中目的基因的表达。我们以survivin为靶点，体外构建短发夹状RNA的表达载体, 观察其对MG63细胞survivin基因表达的影响，为骨肉瘤基因治疗的进一步研究提供实验基础。 1 材料与方法 1.1 材料 人骨肉瘤细胞系MG63为本教研室保存，Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品，pSilence2.1neo为Ambin公司产品， RTPCR试剂盒为MBI公司产品，鼠抗人survivin单克隆抗体及SP试剂盒为Santa Cruz公司产品。 1.2 实验方法 1.2.1 pSilence2.1neosurvivin表达载体构建及细胞转染 参照Harborth等［1］的干涉RNA 设计原则，以人survivin的mRNA序列5′TTCGTCCGGTTGCGCTTTC 3′为靶点，体外合成两端带有BamHⅠ和HindⅢ粘端酶切位点、内含5TTCGTCCGGTTGCGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCGCAACCGGACGAA3发夹状序列的双链DNA，将合成的片段接入pSilence2.1neo载体，筛选、扩增后经测序证实构建成功。分4组进行细胞转染处理：空白组、脂质体组、空载体组、shRNA组。 1.2.2 RTPCR检测细胞survivin mRNA的表达 分别收集转染24、48、72h细胞, 提取细胞总RNA，并进行逆转反应。引物的序列为： survivin：上游：5′ATGGGTGCCCCGACGTTG3′下游：5′AGAGGCCTCAATCCATGG3′，扩增产物436bp。βactin：上游：5′TGGCATTGCCGACAGGATGCAGAA3′下游：5′CTCGTCATACTCCTGCTTGCTGAT3′，扩增产物172bp。以survivin与βactin条带的积分吸光度（IA）比值表示survivin mRNA的相对含量。 1.2.3 免疫组化法检测survivin蛋白的表达 按上法处理细胞24、48、72h后，SP法进行免疫组化染色。以细胞浆和/或核呈现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，并计算阳性表达率：阳性表达率=（每500个细胞中阳性细胞数/500）×100%。 1.2.4 MTT法检测细胞增殖活性 按上法处理细胞24、48、72、96h后，行MTT染色，测OD值，计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=（空白组OD值处理组OD值）/空白组OD值×100%。 1.3 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件，对数据进行t检验。 2 结果 2.1 RTPCR结果 shRNA组436 bp处的条带亮度显著低于其余各组，见图1，与空白组相比shRNA组24、48、72h mRNA 表达抑制率分别为68.52%、74.87%和71.93%， 其抑制作用在24～48h逐步增加，48～72h有所减低，余各组之间无明显差别，见表1。表1 survivin shRNA对MG63细胞survivin mRNA表达的影响 　 2.2 免疫组化结果 空白组、脂质体组、空载体组多数细胞中均出现明显的棕黄色的颗粒状细胞浆和/或核着色，见图2，而shRNA组细胞着色较淡，阳性细胞数目