第10章 动物基因工车奶.pptVIP

动物基因工程 （Animal Genetic Engineering）;主要内容;动物基因工程，原称遗传工程，是应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，创造新生物物种，通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术；或指应用现代化的生物科学和遗传学技术，对动物基因进行操纵或改造的科学工程。 基因工程的核心技术是DNA的重组技术，还包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。;基因工程一般分为4个步骤： 一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”； 二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引人某种细胞； 四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。;第一节 目的基因获取 ; 1 基因组DNA及总RNA的提取 动物DNA的来源（核DNA、线粒体DNA、质粒DNA） 1. 血液、毛发、皮屑（口腔上皮细胞）、精液、化石及 耳朵等活体组织； 2. 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 RNA来源：新鲜组织或细胞;DNA提取方法：常规苯酚-氯仿方法、试剂盒方法---； RNA提取：所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理;2 基因文库 基因文库(Gene library)包括cDNA文库(cDNA library)和基因组文库(Genome library)。 文库: cDNA是指以mRNA为模板,经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA。 RT-PCR：反转录PCR（Reverse Transcription PCR）;cDNA文库：提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 实际为不包含内含子的基因组文库。;基因组文库 （Genomic DNA Library） 从生物组织细胞提取出全部DNA ，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。;文库构建;3 PCR ;PCR的原理：体外DNA复制。 包括高温变性、低温退火和中温延伸过程。;PCR反应五要素 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ Taq DNA聚合酶 1）来自水生栖热菌 Thermusaquaticus；2）良好的耐热性；3）Mg2+依赖性；4）无校正功能 PCR反应条件优化： 引物设计：;PCR的类型;多重PCR:是指在一个单一反应中同时扩增多个序列的反应过程，能够节省时间和精力。 定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA 锚定PCR：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA。 ;巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。 差别显示ＰＣＲ：是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。 ;4 基因克隆 基因克隆（gene?cloning）：或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 克隆（clone）：指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。 　基因克隆步骤：1)?获得待克隆的DNA片段（基因）；2)目的基因与载体在体外连接；３)重组DNA分子导入宿主细胞；４)筛选、鉴定阳性重组子；５)重组子的扩增与／或表达。;5 核酸分子鉴定 1、PCR结合测序： 2、核酸杂交技术 （基于碱基互补配对）;序列测定;* 是southern于1975年创建用以鉴定DNA中某一特定的基因片段