临床PCR技术的发展历史和现状-山东临床检验中心.PPT

临床PCR技术的发展历史及趋势 武春晓 山东省立医院 前言 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR) PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR技术的出现极大地推动了分子生物学的发展，旋即被迅速推广和应用到生命科学的其他领域。而且这种发展还在继续。 PCR的发展历史 PCR的起源 1 最初的设想 2 PCR的首次实现 3 PCR的首次 耐热DNA聚合酶的应用 PCR 的起源: Unusual origin by a non-stereotype scientist 0. PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术。 Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 最初的设想: 被遗忘了10年 DNA 聚合酶Ⅰ的发现 Kornberg 1955 最初的设想 Khorana 1971 Klenow酶的发现 Klenow 1971 核酸测序 Sanger 1977 寡核苷酸引物合成 1980’s DNA限制性内切酶 smith 1970 1. PCR的首次实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 Dr. Kary B Mullis: a non-stereotype scientist Sequence Masters Fred Sanger, 1958 Was originally a protein chemist Made his first mark in sequencing proteins Made his second mark in sequencing RNA 1980 dideoxy sequencing Sanger Method Sequencing Gel PCR的最初实现 2.PCR最早的应用报道  Saiki R K, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic aniplification of β-globin genomic sequences and restriction site anylysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 1985；230：1350～1354 β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断 问题: 不耐热的DNA 聚合酶 1955年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量为109000的一条多肽链构成, DNA聚合酶具有3种功能： 一聚合作用: 以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端。 二有3’→5’外切酶活力: 能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关。 三5’→3’外切酶活力: 它能从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。 Klenow酶 可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段 Klenow片段（Klenow fragment）: 分子量为76000，有聚合酶活性，并有3’→5外切酶活力 另一个片段分子量为34000，具有5’→’3’外切酶活力 Klenow酶的缺陷 高温变性 94 ℃ 失活 特异性差 37 ℃ 碱基错配 扩增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。 操作繁琐 每一个循环后重新加酶 价格昂贵 易污染 开管操作 3.PCR的改进与完善 耐热DNA聚合酶的应用 Taq polymerase 美国黄石国家公园温泉的水生嗜热菌Thermus aquaticus 1976 Taq polymerase 的特性 Taq polymerase in PCR 1988 Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Cetus Co