实验10大肠杆菌非中断杂交实验.docVIP

实验10大肠杆菌非中断杂交实验 一、 实验目的 1．了解细菌有性杂交的原理，学习合作实验，熟悉点菌。 2．掌握利用非中断杂交法进行基因定位的原理，并利用实验结果进行分析。二、 实验原理 F+菌株：带有F因子的菌株 F-菌株：不带F因子的菌株 Hfr品系：F因子整合入细菌染色体 F’菌株：由Hfr菌株染色体中F因子的不正常环出造成F’因子含有供体细胞的特定基因 其中，带有F因子的菌株能够与不带F因子的菌株（F-菌株）进行杂交进而发生基因重组。F因子一般游离于细菌染色体之外，也可能整合到染色体上，因此是一种被称为附加染色体的质粒。带有F因子的细菌，细胞表面会形成一种与细胞接合作用相关的毛状突起，被称为性纤毛，长约1-20μm。性纤毛促使供体和受体细胞特异地配对，在受体细胞上有纤毛的特异结合位点，当性纤毛结合到这些特异性位点之后，开始收缩并将2个细菌拉拢形成作为遗传物质转移通道的接合管，遗传物质的转移就开始了。 F+菌株和F-菌株杂交发生基因重组的频率约为10-7； Hfr品系，其和F-菌株杂交时发生重组的频率为10-4；通过F’因子介导的供体菌向受体菌特定基因的转移被称为性导。 在杂交过程中，接合细菌可以在2小时中缓慢地进行遗传物质的传递，在杂交不同时间进行强力搅拌，打断接合细菌之间的接合管，从而终止遗传物质的转移。所以对应于转移起点越近的基因进入受体菌的几率越大，因此可以通过绘制基因的转移曲线推断出基因顺序并以时间为单位进行染色体作图，这种方法就是中断杂交作图。 本实验采用的是非中断杂交，不同的高频重组品系（Hfr）中F因子与主染色体的整合位置是不同的。Hfr菌株与F-菌株进行结合，染色体由Hfr向F-转移，由于染色体的转移是单方向性的，染色体上的基因都是连锁的，所以，位于Hfr染色体上前面的基因将有更多的机会出现在F-中，越是后端的基因出现的机会就越少。因此，根据细菌结合后F-菌中Hfr上的基因出现的多少就可以测定基因间的相对位置。实验中采用选择培养基筛选法，即亲本不能生长，只有重组子可以生长，同时可利用营养物的加入选择不同的重组子。 三、 实验用具及材料 1）菌株 供体菌：E.coli CSH60 Hfr strs 受体菌：E.coli 57B F- 缺陷型 met-leu-trp-his-arg-lac-gal-ade-ilv-strr 2）实验试剂及培养基 1．液体BP培养基，10×A磷酸缓冲液 ，生理盐水 ，200.0g/L糖溶液，0.25M硫酸镁溶液，盐酸硫胺素（VBI），链霉素溶液，氨基酸溶液及腺嘌呤 2．平板培养基：见表 1。 表 1培养基配表 培养基 选择标记 碳源 Str Arg Ilv Met Leu Ade Trp His A met leu str 葡萄糖 ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ B arg (met leu str) 葡萄糖 ＋ － ＋ － － ＋ ＋ ＋ C ade (met leu str) 葡萄糖 ＋ ＋ ＋ － － － ＋ ＋ D trp (met leu str) 葡萄糖 ＋ ＋ ＋ － － ＋ － ＋ E his (met leu str) 葡萄糖 ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ － F lac (met leu str) 乳糖 ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ G gal (met leu str) 半乳糖 ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ 将培养基配制完成后，在超净工作台将培养基倒入培养皿内制成平板，待培养基冷凝后备用。 3）其他用具 三角瓶、试管、烧杯、培养皿、取液器、接种环、涂棒、牙签、体积分数70%酒精。 实验操作 活化菌种：实验前，从冰箱内取出保存的受体及供体菌种在37℃下活化24h， 然后分别用接种针挑一环菌至5mLBP液体培养基中在37℃、200r/min下震荡培养16h。 扩大培养：从上述5mL培养液中用取液器分别吸取供体和受体菌1mL装入到另一新的5mL培养基内，在37℃下培养2～3h。此时，从供体和受体的培养瓶中分别取0.1mL菌液均匀涂布在A平板培养基上作为对照。将培养皿置于37℃恒温培养箱倒置培养。 杂交：用取液器从扩大培养后的菌液中分别吸取供体菌0.2mL、受体菌4mL混合于一个三角瓶内，将其置于摇床37℃、200r/min下震荡培养1.5h。 杂交菌液培养：杂交结束后，从杂交液中吸取0.1mL到A培养皿上，用涂棒将杂交液涂布均匀。 稀释涂布：分别涂布两个稀释5倍和10倍的A平板培养基，置于37℃温箱倒置培养。 用无菌的牙签挑取A平板上的菌落，分别接种在B～G选择培养基的对应位置上，最后在选择培养