应用端粒酶逆转录酶基因使兔关节软骨细胞永生化的初步探究.pdfVIP

应用端粒酶逆转录酶基因使免关节软骨 细胞永生化的初步研究 硕士生姓名： 张荣平 指导教师： 张卫国 教授 专业名称： 骨外科学 摘 要 目的：将外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)导入到新西兰大白兔第二 代关节软骨细胞，探讨该基因能否激活兔关节软骨细胞的端粒酶活性， 并延长细胞在体外培养的寿命，并为以后的永生化兔关节软骨细胞系的 建立奠定基础。 PT67包装细胞，收集病毒上清液，并用NIH3T3细胞测定病毒上清液的 病毒滴度：2．第二代兔关节软骨细胞分别被上述两种逆转录病毒上清液 感染后，经G418药物压力筛选获得克隆细胞并扩增，从而初步建立永 生化兔关节软骨细胞：3．用RT-PCR方法检测永生化兔关节软骨细胞中的 hTERT．mRNA表达，并与第二代的兔关节软骨细胞相比较。 结果：1．质粒稳转包装细胞后经G418筛选后获得了稳定产毒的抗性 表达，并和正常PT67细胞相对照。检测结果发现在抗性克隆株PT67和 正常PT67细胞中均可见一条扩增带，但抗性克隆株PT67的条带明显强 有转录，但其外源性的hTERT基因使其转录明显增强。并测得稳转后病 毒的滴度为2．O×l05CFU／ml；瞬转包装细胞产生的病毒上清液的病毒滴度 1 为1．Ox06CFU／ml。2．经流式细胞仪检测，稳转包装细胞产生的病毒上清 液感染兔第二代关节软骨细胞的感染率是28．554-6．99％，瞬转包装细胞产 生的病毒上清液感染兔第二代关节软骨细胞的感染率是81．42士11．45％。 未感染的兔第二代关节软骨细胞做为空白对照，其感染率为0．23+0．05％。 通过方差分析p0．05，认为两种病毒感染方法有显著性差异。3．RT．PCR 检测永生化兔关节软骨细胞的hTERT-mRNA表达时，可见1 45bp的特异 性电泳带，而未感染的第二代兔关节软骨细胞却未见条带，说明hTERT 基因被成功导入到第二代兔关节软细胞中并被表达。 结论： 1．成功构建了表达hTERT基因片段的逆转录病毒。 得的病毒上清液感染第二代兔关节软骨细胞，经流式细胞仪检测后认为 瞬转方法获得病毒感染率高。 3．在逆转录载体的介导下将外源性hTERT基因导入兔关节软骨细 胞，可激活兔关节软骨细胞的端粒酶活性。 关键词：hTERT端粒酶 逆转录病毒 永生化 关节软骨 2 on Elementarystudyimmortalizationofrabbit transfection chondrocyteCellsby withhuman telomerasereverse transcriptase Master degreecandidate：ZhangRongPing Wei Guo Supervisor：Professor Zhang Maj or：surgery(orthopedics) Abstraet isto ifthehTERTcanactivatethe Objective：Thepurposeexplore gene t