丹参酮ⅡA对鼠肝星状细胞活化Ca2+效应抑制作用.docVIP

丹参酮ⅡA对鼠肝星状细胞活化Ca2+效应抑制作用【摘要】 目的 研究丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)药物血清是否具有抑制肝星状细胞(HSCs)胞浆游离钙(［Ca2+］i)增高的作用。方法 健康SD大鼠32只,按随机数字表随机分为4组:肝纤维化模型丹参酮ⅡA组(8只) 给予用精制橄榄油配制的 40%CCl4 溶液,9 周后腹腔注射丹参酮ⅡA(15 mg/kg)15 d;肝纤维化模型对照组(8只)给予用精制橄榄油配制的40%CCl4 溶液，9周后灌服生理盐水15 d;正常大鼠丹参酮ⅡA组(8只)仅给予等量精制橄榄油9周,然后腹腔注射丹参酮ⅡA(15 mg/kg)15 d;正常对照组(8只)仅给予等量精制橄榄油，9周后灌服生理盐水15 d。结束后,经下腔静脉取血并分离血清。采用盲法,用上述 10%血清培养 HSCs24 h并负载好 Fluo23PAM后使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测 HSCs［Ca2+］i。结果 ①经正常大鼠丹参酮ⅡA组及肝纤维化模型丹参酮ⅡA组的血清预处理的 HSCs,其［Ca2+］i荧光强度相对值均明显低于肝纤维化模型对照组(P 1.8.3 LSCM检测 HSCs［Ca??2+?］??i? 将上述经制备的动物血清预处理的细胞负载好 Fluo-3/AM后上机检测,每组相同位置选取8个细胞进行荧光强度分析。? 1.8.4 AngⅡ刺激后LSCM检测 HSCs［Ca??2+?］??i? 将上述经药物血清预处理的细胞及对照组细胞负载好Fluo-3/AM后上机检测,给予AngⅡ(10??-7?mmol/ L)刺激后分析细胞荧光强度变化百分数。? HSCs胞浆［Ca??2+?］??i? 的计算方法:利用LSCM所配备的计算与图像软件(leica confocal software,TCS SP2),计算荧光强度相对值,荧光强度越大, ［Ca??2+?］??i?越高; ［Ca??2+?］??i?的变化用Fluo-3/AM与 Ca??2+?结合后荧光强度变化百分数表示。? ［Ca??2+?］??i?荧光强度变化百分数(%) = (F-F??0?)/F??0?×100%? 其中 F为LSCM测量时整个细胞的平均荧光强度,F??0? 为用药前的［Ca??2+?］??i? 荧光强度。? 1.9 统计学处理 结果以均值±标准差(x±s)表示,采用 SPSS 10.0软件行单因素方差分析。? 2 结果? 2.1 HSCs的 Ca2+荧光成像 LSCM下 Ca2+成像的 HSCs仍可见普通倒置显微镜下的形态特征,细胞内［Ca??2+?］i 的浓度的高低由细胞被激发出的荧光强弱表示,荧光强度越强表示［Ca??2+?］i 浓度越高,反之则越低。本实验 HSCs与Fluo-3/AM孵育后,所有细胞均被染色,且每组各细胞间的强度基本一致。? 2.2 静息状态下 HSCs［Ca??2+?］??i? 的动态变化 为证明细胞培养液本身对 HSCs［Ca??2+?］??i?的影响,本研究观察了6个 HSCs在实验所需的时间内(5 min) ［Ca??2+?］??i?的动态变化。结果表明,HSCs在实验所需的整个时间内［Ca??2+?］??i? 荧光强度基本保持稳定。? 2.3 不同浓度AngⅡ对 HSCs的累积反应曲线 给予AngⅡ浓度梯度刺激 HSCs后, ［Ca??2+?］??i? 荧光强度逐渐增加,作出累积反应曲线后,得到EC50值约为1.1×10??-7?mol/L。? 2.4 丹参酮ⅡA药物血清对 Ang Ⅱ介导的 HSCs［Ca??2+?］??i?变化的影响 ①经正常大鼠丹参酮ⅡA组及肝纤维化模型丹参酮ⅡA组药物血清预处理 HSCs后,其［Ca??2+?］??i?荧光强度相对值均显著低于经肝纤维化模型对照组血清预处理的 HSCs［Ca??2+?］??i? (均为 P 1