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重组蛋白纯化的基本策略 作者：佚名????实验频道来源：本站原创????点击数： 1241????更新时间：2004-12-21 及的具体步骤最终取决于样品的性质。但也有共同可参考的阶段 ? 捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。 ? 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。 ? 精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。 ? 分离方法的选择 ??? 根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法： 方法 电荷（等电点） 离子交换（IEX） 分子量 凝胶过滤（GF） 疏水性 疏水（HIC）反相（RPC） 特异性结合 亲和（AC） 　 　 　 　 　 每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。 ??? 处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。 ??? 速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。 ??? 回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。 ? ??? 在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表： 技术 主要特点 捕获 中度纯化 精制 样品起始状态 样品最终状态 IEX 高分辨率 高容量 高速度 ★★★ ★★★ ★★★ 低离子强度 样品体积不限 高离子强度或pH改变。 样品浓缩 HIC 分辨率好 容量好 高速度 ★★ ★★★ ★ 高离子强度 样品体积不限 低离子强度 样品浓缩 AC 高分辨率 高容量 高速度 ★★★ ★★★ ★★ 结合条件特殊 样品体积不限 洗脱条件特殊 样品浓缩 GF 高分辨率 （使用Supedex） ? ★ ★★★ 样品体积（总柱体积的5%）和流速范围有限制 缓冲液更换（如果需要） 样品稀释 RPC 高分辨率 ? ★ ★★★ 需要有机溶剂 在有机溶剂中，有损失生物活性的风险 　 1、? 2、? HIC是捕获阶段的理想方法。 3、? GFIEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。 4、? 5、? IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。 6、? RPC方法用于精制阶段。 ? 注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。 附：纯化工艺路线