引物设计-abc.pdfVIP

引物设计 严昊，张智慧，申梁，马兴杰 介绍 引物设计的原则 Primer5介绍 Oligo6介绍 上游引物和下游引物  什么是上游引物，什么又是下游引物？ 3‘…. ATCCGCACGCACGCACAGAGC…..5’ template 5’…TAGGCCG…3’ Primer upstream DNA聚合酶 只能从5‘向3’ 延伸 5’…TAGGCCGTGCGTGCGTGTCTCG….3’ 3’……CAGAGC….5’ primer downstream 谁先延伸就是上游引物，后延伸的就是下游引物 参考值  引物长度（primer length）  产物长度（product length）  序列Tm值(melting temperature)  ΔG值(internal stability)、  二聚体，发夹结构（Dimer and hairpin）  错误引发位点（false priming site ）  引物及产物GC 含量（composition ）  3‘末端稳定性（3’ End Stability ）  引物的长度一般为15-30bp，常用的是18- 27bp 。  因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即 Taq 酶的最适温度。 Tm值与GC含量  GC含量大，Tm值大，解链温度高。  对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比 较合适。Tm值控制在50-70之间  有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量 不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以 及Tm 值保持接近。 ΔG值 ΔG -2 -6 -8 -10  反映了引物与模板结合 3’ 的强弱程度 产 100% 40% 20% 0  一般情况下，引物的ΔG值最好 量 呈正弦曲线形状，即5’端和中间 ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较 低，且不要超过9 （ΔG值为负值， 这里取绝对值），如此则有利于 正确引发反应而可防止错误引发。 Dimer Dimer是引物之 发卡结构的稳定性可以 用自由能衡量。自由能 间的配对，如果 大小取决于碱基配对释 配对区域在3 末 放的能量以及折叠DNA 端问题会更为严 形成发卡环所需要的能 量，如果自由能值小于 重，3 末端配对 0 则该结构可以干扰反 很容易引起引物 应。 attention 二聚体扩增。 hairpin