《畜肉食品中鸭源性成分PCR检测方法》 标准文本.docVIP

ICS67.050 X 04 备案号： DB22 吉林省地方标准 DB XX XXXXX—XXXX 畜肉食品中鸭源性成分PCR检测方法 Determination of duck materials in meat by PCR method XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 吉林省卫生厅 发布 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由吉林省卫生厅提出并归口。 本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：史艳宇、邴炜、华蕾、刘金华、初真林、王莹、李媛媛、周亮、刘晓晖、刘静秋、王潇、赵立群、任明月、王颖。 畜肉食品中中鸭源性成分检测方法 PCR法 范围 本方法规定了畜肉食品中鸭源性成分检测方法。 本方法适用于新鲜、冰冻畜肉和肉干、肉酱、酱肉、火腿、肉松等畜肉加工食品中鸭成分定性检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 鸭源性成分 duck-derived materials鸭种属特异性DNA片段。原理对样品进行DNA提取，使之适用于PCR检测技术，通过PCR扩增，检测其中是否含有鸭特异性基因序列，达到对鸭源性成分定性PCR检测的目的。 除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。F：5’- CATCTATCCTGCTAGCCGCC -3’ R：5’- GGCTTGAGTGGAAGAATGCC -3’ CTAB提取缓冲液：CTAB 20g/L，氯化钠1.4 mol/L，Tris o.1 mol/L，EDTA 20 mmol/L，pH 8.0，高压灭菌。使用前加入终浓度为2%的β-巯基乙醇。 CTAB沉淀液：CTAB 5 g/L，氯化钠 0.04 mol/L，pH 8.0，高压灭菌。 氯化钠溶液：1.2 mol/L。 蛋白酶K溶液：冻干品，用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为20 mg/mL的溶液，分装后于-20 ℃保存，避免反复冻融。 无水乙醇、异丙醇等有机试剂。 食物基因组DNA提取纯化试剂盒。 10×PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L氯化钾，15 mmol/L氯化镁。 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。 Taq DNA聚合酶。 分子量标记：100 bp DNA Marker。 琼脂糖：电泳纯。 天平：感量0.01 g。PCR仪。 电泳仪。 凝胶成像系统。 高速冷冻离心机最高转速12 000 r/min以上。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。振荡器。 恒温水浴锅。 冰箱：2 ℃～-20 ℃。 微量可调移液器及配套吸头0.5 μL~ 10 μL、10 μL ~100μL、20μL ~200μL、200μL ~1 000μL。 离心管1.5 mL。采样工具 下列采样工具应经180 ±2 ℃，2 h高温灭菌：剪刀、镊子、钎子。 样品采集 待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。 样品储运 样品采集后，将采集的样品放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品放入一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，送实验室。从原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分用绞碎机绞碎，充分混匀，用四分法缩分出不少于500 g作为试样。装入清洁容器中，加封后，明标记。保存 检测过程中设置核酸提取空白对照、PCR扩增空白对照、PCR扩增阴性对照、PCR扩增阳性对照。加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式的样品前处理尽量去除样品中的盐、糖和色素。具体步骤是：取约500 mg样品加入50 mL离心管，加入约2倍体积的双蒸水，上下颠倒充分混匀，8 000 g离心5 min并弃去上清夜，重新加入约2倍体积的双蒸水，上下颠倒混匀，8 000 g离心5 min并弃去上清夜，必要时用三氯甲烷清洗样品1次。称取500 mg待检样品于15 mL离心管中，加入5 mL CTAB裂解液和20μL蛋白酶K溶液，65 温育1 h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时，再加入适量CTAB裂解液；8 000 g离心5 min，取1 mL上清于2 mL离心管中，加700 μL三氯甲烷，漩涡震荡30 s，1 4500 g离心10 min，收集600 μL~650 μ