《黄酒中氨基酸测定方法》行业标准编制说明.docVIP

《黄酒中氨基酸的测定方法》行业标准编制说明  征求意见稿 《黄酒中氨基酸的测定方法》 行业标准起草工作组 二O一一年二月 一、任务来源 根据发改办工业[2008]1242号文件下达的行业标准计划任务，《黄酒中氨基酸的测定方法-高效液相色谱法》由中国食品发酵工业研究院等负责起草，全国食品发酵标准化中心归口管理。 二、制标的原则 本标准是按照GB/T1.1-2000《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T120001.4-2001《标准编写的规则 第4 部分：化学分析方法 》的要求编写的。 三、标准化方法研究过程 本标准起草通过查阅大量国内外氨基酸测定的方法，通过对各方法的特点进行对比分析，结合实验室的条件和方法适用性，选择异硫氰酸苯酯（PITC）为柱前衍生高效液相色谱法进行测定。对样品的处理方法，衍生反应条件、色谱分离条件等进行了优化，通过回收率、稳定性及精密度等一系列的研究，建立了液相色谱法同时进行天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、4-氨基丁酸（Aba）、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Va1)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸（Trp）、赖氨酸(Lys)等18种氨基酸方法本方法经过 四、 研究背景 氨基酸是一种两性化合物, 它的分子中既含有氨基又含羧基, 由于这两种基团的强弱性不同, 所以氨基酸既有酸性的也有碱性的饮料酒中氨基酸的种类和含量是影响其风味和衡量其营养质量高低的一项重要指标酒的甜度和酸度主要由糖类和有机酸决定，而其它诸味则主要决定于游离氨基酸的组成，氨基酸赋予了酒较高的营养价值因此研究酒中游离氨基酸含量快速、准确的测定方法，对研究酒的营养价值和质量控制具有十分重要的。国内外早已将氨基酸自动分析仪用于氨基酸的分析测定, 大多数氨基酸缺乏天然的紫外或荧光吸收, 进行化学衍生化紫外或荧光吸收已成为氨基酸分离和分析的重要手段邻苯二甲醛(OPA)，9-芴基甲氧基羰酰氯(FMOC-CL)异硫氰酸苯酯(PITC)等。OPA衍生效率高，但是不能与二级氨基酸直接反应，需要用FMOC(能同时与一级氨基酸和二级氨基酸反应)来补充 图1 氨基酸和PITC反应方程 五、 本标准分析条件的优化 1 衍生反应条件的选择 1.1 反应时间的确定 采用氨基酸混标工作液，将衍生方法中的衍生时间设定为10，20，30，45，60min，按上述时间衍生，进样分析后，比较各氨基酸峰面积的变化（以Glu、Ser、Arg、Gly、Pro、Try代表），试验结果表明氨基酸在45 min趋于稳定，60 min后衍生完全见图2，因此本文选择60min为衍生反应的时间。 1.2 衍生剂的去除和介质酸度的调节 过量衍生试剂PITC的存在，对色谱峰会有一定干扰，去除PITC常用的方法有真空干燥和有机溶剂萃取，经过比较发现前者操作繁琐，本方法采用正己烷萃取去除PITC，达到净化的目的；反应产物的介质为偏碱性介质，对色谱的峰形和重现性有一定的影响，且该产物在中性介质较为稳定，因此本方法采用加入10%乙酸，将反应后的介质调节为中性。 2 色谱条件的选择优化 2.1 色谱分离条件的优化 18种氨基酸衍生物性质较为接近，尤其是Gly-His、Arg-Thr、Thr-Aba、Aba-Ala、Ile-Leu等较难分离，同时黄酒中存在大量干扰物质，如含量较高的氨根离子等也和PITC反应，其产物与Ala，Pro较为接近，因此，能否有效的分离18种氨基酸是定量测定的重要因素；本研究首先选用不同C18色谱柱进行18种氨基酸的测定，选择对18种氨基酸分离效果好的色谱柱，然后开展流动相比例的选择优化，对流动相pH、柱温及离子对试剂的等因素进行了研究，最终采用梯度洗脱的方式18种氨基酸达到良好分离见图。 图18种氨基酸标准溶液的色谱图图色谱图ly-His，Arg-Thr，Thr-Aba,Aba-Ala, Ile-Leu,等5组较难分离氨基酸分离度的影响，由图5可以看出Thr-Aba和Gly-His随pH提高，分离度提高，Aba-Ala和Ile-Leu 随pH的提高分离变化较小，Arg-Thr虽pH的升高，分离度迅速降低，因此本研究选择pH为6.2的流动相。 图5 流动相pH值对氨基酸分离的影响（1）Gly-His，（2）Arg-Thr，（3）Thr-Aba，（4）Aba-Ala，（5）Ile-Leu 。 3 标准曲线、相关系数mmol/L)进行回归处理，计算线性回归方程。结果表明：18种氨基酸的浓度在0.125～1.0mmol/L时其浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数