柱层析法.PPT

层析技术的发展 1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因．又常称为层析法。 100多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。 几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。 趣味实验：　柱层析法 【实验步骤及现象】 ? 废旧的酸式滴定管 装柱：脱脂棉堵住底部活塞出口，管中装入研细的粉笔末，用玻璃棒轻轻压实、压均匀 加样：柱上盖一张滤纸，滴加1～2滴红、蓝墨水的等量混合物（可适当加些水） 展开：墨水混合液沿柱向下移动，逐渐形成不同的色带，红色带在下，蓝色带在上。 【简易的方法】取一只白粉笔，在距大头一端的2 cm处，用笔蘸上墨水画一个圈（墨水是红、蓝墨水的等量混合液）。将粉笔的大头朝下，立在盛有适量水的培养皿中。水作展开剂，随着水沿粉笔的上升，带动红、蓝墨迹向上移动。由于红墨水上升得快，所以红色带在上方；由于蓝墨水上升得慢，所以蓝色带在下方。这样便形成了柱色谱。 分配层析（Partition chromatography） 根据物质在两种不相混溶（或部分混溶）的溶剂间溶解度不同，从而有不同的分配来实现分离的方法。属于液—液层析。 离子交换剂的种类 亲和层析 具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。 亲和层析的实验室应用举例 用Ni柱纯化带有His标签（ 6×组氨酸）的融合蛋白 ： 应用最广泛 谷胱甘肽S转移酶（GST）-tag纯化法： 利用谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶之间酶和底物的特异性的作用力 亲和层析（Affinity chromatography） 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。 配体与载体结合 （固相化） 装柱 （亲和层析柱） 亲和吸附 （生物高分子与配体专一结合） 洗柱 亲和层析的基本过程 Affinity Chromatography 亲和层析 * * 目 录 生物化学与分子生物学实验教学中心 层 析 法 Chromatography 基本概念 层析法的分类 几种常用的层析方法 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析 基本概念 层析法 通过在固定相和流动相之间的物理和化学分配差异将混合物中的两种或多种化合物相互分离的方法之总称。 所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。 层析法利用混合物中各组分的理化性质（如溶解度、吸附能力、电荷、分子量、分子极性、亲和力等）各不相同，使各组分在流动相中移动速度不同而集中分布在不同的区域，借此将各组分分离。 组分A 组分B 固定相 吸附 结合等 + 流动相 解除上 述作用 反复进行 组分A 组分B 移动速度不同 层析法的分类 按两相所处的状态分类 液-固 层析法 液-液 层析法 液体 气-固 层析法 气-液 层析法 气体 流 动 相 固体 液体 固定相 气相层析 液相层析 按层析原理分类 各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同 分配层析法 吸附层析法 分 离 原 理 名 称 各组份在吸附剂表面吸附，固定相是固体吸附剂，对各组分吸附能力不同 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同 凝胶层析法 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂形成的盐键数目不同 离子交换层析法 分 离 原 理 名 称 续上表 亲和层析法 固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此与无亲和力的其它组份分离 按操作形式不同分类 将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离 薄层层析法 固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离 柱层析法 操 作 形 式 名 称 将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离 薄膜层析法 用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离 纸层析法 操 作 形 式 名 称 续上表 几种常用的层析方法 吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 吸附层析