荧光标记复合pcr扩增微卫星位点的构建与优化-生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（１１）：６１～６５ 荧光标记复合ＰＣＲ扩增微卫星位点的 构建与优化 １ ２ ３ １ 朱泽远 　ＷＡＮＧＹａｊｕ　施用晖 　乐国伟 （１国家食品科学与安全重点实验室　无锡　２１４０３６　２新加坡国立大学医学院生理学系　新加坡　１１７５７９） （３江南大学食品学院　无锡　２１４０３６） 摘要　采用毛细管电泳技术，构建并优化了荧光标记复合ＰＣＲ同时扩增多个微卫星位点。根据设 计所扩增微卫星位点的期望长度，将９个微卫星位点分成两组，５个位点用ＦＡＭ（蓝色）标记，４个位 点用ＨＥＸ（绿色）标记；两种荧光类型分组优化，用琼脂糖胶电泳检测。荧光标记的复合ＰＣＲ扩增８ 个中华绒螯蟹样品的９个微卫星位点，采用ＡＢＩ３７３０ｘｌ毛细管电泳检测，以ＲＯＸ５００（红色）为长度标 准物，结果经Ｇｅｎｅｍａｐｐｅｒ３．５软件分析，检测结果表明毛细管电泳检测荧光标记复合ＰＣＲ产物不仅 精确读取微卫星位点的长度（分辨率高达１ｂｐ），还能区分微卫星位点复制时滑链所引起的“回声 斑”；调整各微卫星位点引物比例使所有位点扩增强弱均匀。逐一检测复合ＰＣＲ基本参数（ｄＮＴＰ浓 度、ＰＣＲ程序和模板ＤＮＡ用量）对复合ＰＣＲ产物的影响，优化ＰＣＲ。结果表明通过毛细管电泳检测 荧光标记复合ＰＣＲ产物来读取微卫星位点的基因型具有精确性、高效性和稳定性。 关键词　毛细管电泳　复合ＰＣＲ　微卫星 中图分类号　Ｑ８１９ 　　微卫星（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）是指遍布于真核生物基因组 　　毛细管电泳技术是近年来分析化学中发展最为迅 的简单重复核苷酸序列（一般为２～６个碱基重复），又 速的领域之一。它使分析科学得以从微升水平进入纳 ［５］ 称短串联重复（ｓｈｏｒｔｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ，ＳＴＲ）。微卫星 升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能 。 ＤＮＡ作为一种分子标记，具有数据大、分布广且均匀、 采用毛细管电泳检测特定微卫星的长度具有比传统的 多态信息含量高、共显性遗传、选择中性等特点。微卫 聚丙烯酰胺凝胶电泳更高的精确性，分辨率可高达 星已被广泛应用于群体遗传研究、生物遗传作图、个体 １ｂｐ，此外，还能灵敏分析产物浓度，有助于减少错 ［１，２］ ［６］ 间亲缘关系鉴定、食品跟踪等方面 ；此外，微卫星 读 。应用不同荧光标记可以解决不同ＰＣＲ扩增位 还具有非损伤性研究的优点，即粪便、皮毛、分泌物等 点长度的重叠，极大的提高效率。毛细管电泳技术分 均可以作为样品。近年来，有关微卫星位点分离和应 析微卫星的主要成本之一是购买商品化的长度标准物 用的研究迅猛增加，它逐渐成为最流行的分子遗传标 （比如ＲＯＸ５００），而实验室自制长度标准物 ＲＯＸ的成 ［３］ 本仅为商品化标准物的１０％，明显降低其成本，极大地 记之一 。传统微卫星的检测方法是聚丙烯酰胺凝胶 ［７］ 电泳后银染，这一方法精确性差，灵敏度低，易出现误 加快了毛细管电泳技术的普及应用 。 ［４］ 　　复合ＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ）可以在一个ＰＣＲ反应中 读，不同实验室的结果难以比较 。此外，聚丙烯酰胺 凝胶电泳自动性差。解决这一问题的有效途径是应用 扩增多个目的片段，将降低 ＰＣＲ的成本和提高效率。