组织化学法（Histochemical method）.docVIP

组织化学法（Histochemical method） SP (streptavidin - perosidase) 法, 即链霉菌抗生物素蛋白 - 过氧化物酶连结法. 按标记物质的种类, 如荧光染料、放射性同位素、酶 (主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶) 、铁蛋白、胶体金等, 可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等.按染色步骤可分为直接法 (又称一步法) 和间接法 (二步、三步或多步法); 按结合方式可分为抗原 - 抗体结合, 如过氧化物酶 - 抗过氧化物酶 (PAP) 法和亲和连接, 如卵白素 - 生物素 - (ABC) - 过氧化物酶复合物 法、链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶连结 (SP) 法等, 其中sp法是最常使用的方法. 一般的sp法步骤啊, 具体如下: 1.烤片, 68℃, 20分钟, 2. 常规二甲苯脱蜡, 梯度酒精脱水; 二甲苯i 20min - 二甲苯ii 20 min - 100% - 100% 酒精i 10min II - 5min 10min - 95% - 80% - 70% 5min 5min 3.阻断 灭活内源性过氧化物酶: 3% H2O2 37℃孵育10min, pbs冲洗3x5min; 4. 抗原修复: 置0.01m枸橼酸缓冲液 (pH 6.0) 中用煮沸 (95℃, 15－20min), 自然冷却20min 以上, 再用冷水冲洗缸子, 加快冷却至室温, pbs冲洗3x5min. 5. 正常羊血清工作液封闭, 37℃10 min, 倾去勿洗. 6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育过夜, pbs冲洗3x5min (用pbs缓冲液代替一抗作阴性对照); 滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, pbs冲洗3x5min; 7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液, 37℃孵育30min, pbs冲洗3x5min; 8. DAB / h2o2反应染色, 自来水充分冲洗后, 苏木素复染, 常规脱水, 透明, 干燥, 封片. 1 石蜡切片脱蜡和水化后, 用pbs (ph7.4) 冲洗三次, 每次5分钟. Pbs配制 (2000ml) ph7.4 氯化钠: 17 g 磷酸二氢钠: 0.4g 磷酸氢二钠: 6.3g 2 根据每一种抗体的要求, 对组织抗原进行相应的修复.我科采用压力锅进行抗原修复, 取一定量的修复液于压力锅中, 加热至沸腾, 将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上, 放入已沸腾的缓冲液中, 盖上锅盖, 扣上压力阀, 继续加热至喷气, 从喷气开始计时, 2分钟后, 压力锅离开热源, 冷却至室温 (也可以稍冷后, 在自来水龙头下加速冷却).取出玻片, 先用蒸馏水冲洗两遍 (用蜡在组织周围划圈, 防止抗体跑散, 但圈要大一点), 之后用pbs (ph7.4) 冲洗三遍.每次5分钟. 柠檬酸缓冲液的配制 (ph6.0) 0.1m柠檬酸: (4.2g + 200ml蒸馏水) 0.1m柠檬酸三钠 (14.7g + 500ml蒸馏水) 取柠檬酸三钠41ml + 柠檬酸9ml加入450ml蒸馏水中, 总量为500ml即可. 3 配制3% 过氧化氢阻断内源性过氧化物酶, 孵育十分钟. Pbs90 ml + 30% 过氧化氢10 ml, 现用现配并摇匀, 盖上盖子, 防止见氧分解挥发. 4 pbs冲洗三次, 每次5分钟. 5% 羊血清封闭 滴加4, 室温30分钟, 以减少非特异性染色. Pbs10 ml + 正常羊血清400 UL 6 甩去羊血清, 根据不同的项目配制并滴加不同的一抗, 浓缩型的抗体一定要在购买后先用已知的阳性片做梯度实验, 根据结果情况找出最佳稀释浓度再用到临床诊断.工作液也应该在购买后先用已知的阳性片检测抗体的染色效果, 直接滴加即可.每次还应带上阳性对照和阴性对照, In order to ensure the reliability of the result. Add a sufficient amount of resistance to each slice and put it in a damp box to prevent slicing, drying, affecting the result and incubation at room temperature for 2 hours. Preparation of antibody dilution serum bovine serum albumin: 2mg Sodium azide: 10 ~ 20ml Double distilled water: 10ml 7 PBS, rinse three times, 5 minutes each. Incubate 8 drops wit