胚胎RNA分离和cDNA文库构建-分析测试技术专题知识库.PDF

维普资讯 第37卷 第4期 海 洋 与 湖 沼 Vo1．37．NO．4 20 06 年 7 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA July，200 6 皱纹盘鲍 (HaliotisdiscushannaiIno)胚胎 RNA分离和 cDNA文库构建 刘 晓 赵 敏 高其康” 张国范 (中国科学 院海洋研究所 青岛 266071) (中国科学院海洋研究所 青岛 266071；中围科学 院研究生院 北京 100039) 十(浙江大学分析测试 中心 杭州 310029) 提要 从皱纹盘鲍胚胎样本 中分离RNA并构建 了eDNA文库。分别收集孵化 8、10和 12h 的皱纹盘鲍胚胎，用抽滤除菌的海水反复悬浮胚胎，将这 3个发育阶段的胚胎样本等量混合 后用 TRIZOL试剂提取总RNA，将提取物用酚一氯仿一异戊醇再抽提 2次，分离获得高质量的总 RNA。从总 RNA中分离mRNA，构建 了皱纹盘鲍混合胚胎的 eDNA文库，未扩增胚胎文库的 滴度为5．0×10。pfu／ml，重组率为94．12％，插入片段均大干400bp，70．6％克隆的插入片段分 布在 1000—1500bp之间，扩增后的文库滴度为 3．06×10pfu／ml。 关键词 皱纹盘鲍，胚胎，eDNA文库，基因表达 中图分类号 Q132 皱纹盘鲍 (HaliotisdiscushannaiIno)自然分布 器官分化的基 因可能在 胚胎和幼虫 的不 同阶段 于北太平洋海区。从上世纪80年代中期实现人工 表达 。但到 目前为止 ，有关皱纹盘鲍胚胎和幼虫 育苗 以来 ，我国的皱纹盘鲍养殖业发展较快 ，现 已 阶段的基因表达研究均未见报道 。 成为重要的养殖贝类。但 目前 国内外对于皱纹盘 与陆生生物不同，贝类 的胚胎和幼虫生活在 鲍的功能基因研究仍很缺乏 ，目前在 genebank中 自然水环境中；与成体阶段的材料相 比，皱纹盘鲍 公布的皱纹盘鲍核酸序列不到200条，其中多数是 的胚胎和幼虫样本代谢更为旺盛。针对上述特点， 微卫星序列和核糖体 RNA序列。已发布的重要功 作者在样本收集、RNA分离等过程 中均进行 了改 能基因有：褐藻胶裂解酶基因(Shimizuetal，2003)、 进 ，并成功构建了皱纹盘鲍不同发育阶段 的胚胎 纤维素酶基 因(Suzukietal，2003)、精子细胞溶素 eDNA文库与幼虫 eDNA文库。本文 中作者将 以 mRNA序列 (Leeetal，1995)、卵黄膜细胞溶素受 皱纹盘鲍 的后 期胚胎 eDNA文库 (Haliotisdiscus 体蛋 白基因 (Galindoetal，2003)、细胞色素氧化 hannaiembryolibrary，简称 HD—emb文库)为例报 酶亚基 I编码基 因 (Metzetal，1998)等。对于功 告胚胎样本收集 、RNA分离等技术。本文 中所报 能基因尚了解很少的皱纹盘鲍来说 ，通过构建全 道的方法可为水生生物早期发育阶段的大分子分 长 eDNA文库进行 EST序列分析 ，或结合使用表 离提供技术借鉴，所构建的全胚胎 cDNA文库将为 达谱基 因芯片等手段是分析和克隆特殊时空条 皱纹盘鲍胚胎发育过程 中的基因表达及与胚胎分 件下表达的功能基因的一种可行策略。 化相关的重要功能基因研究奠定基础 。 胚胎和幼 虫是贝类生活史 中两个非 常重要 1 材料与方法 的发育阶段 ，在该两个 阶段 中分化形成了除生殖 1．1 实验材料 腺外 的几乎所有组织和器官 ，因此启动多种重要 本研究所用实验材料皱纹 盘鲍 (Halioti