细菌pcr检测的质控方法iac.ppt

* * * * Crown Gall冠瘿一种Plant Tumors 植物肿瘤 * 细胞分裂素(cytokinin)生物合成酶的编码基因(tmr)，当其发生突变的时候会激发冠瘿瘤出现大量的增生(多根性突变体)，所以又叫做根性肿瘤(rooty tumor)基因。这个基因编码的一种细胞分裂素生物合成酶，即异戊烯转移酶(isopentenyl transferase)，能催化玉米型的细胞分裂素的合成。 根瘤诱导质粒 Ti质粒（tumor-inducing plasmid） * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * EBV epstein-barr virus EB病毒 CMV cytomegalo virus 巨细胞病毒 VZV varicella-zoster virus 水痘-带状疱疹病毒 HSV herpes simplex virus 单纯疱疹病毒 HBV　Hepatitis B virus 乙型肝炎病毒 * * * * * * * IAC构建方法-复合引物（续） IAC构建方法-复合引物 IAC构建方法-复合引物 目标DNA：220bp(Agrobacterium tumefaciens根癌土壤杆菌Ti质粒中的tms2基因) IAC构建方法-复合引物 IAC 300bp 目标DNA 220bp IAC构建实例四-复合引物 IAC构建方法-复合引物（续） IAC构建方法-复合引物 复合IAC技术一-重叠延伸 复合IAC技术一-重叠延伸 overlapping and extension PCR (OE-PCR) 复合IAC：IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-2, IL-10,TNF-α, TNF-β and IFN-γ 6个寡核苷酸（43-58个碱基，其中含20个互补重叠碱基） 第一步扩增：重叠碱基作为引物扩增 第二步扩增：对第一步扩增产物使用特异性引物再扩增 复合IAC技术一-重叠延伸 复合IAC技术二-复合引物 复合IAC技术二-复合引物 复合IAC技术二-复合引物 复合IAC技术二-复合引物 选择性PCR-大片段IAC 选择性PCR-大片段IAC 目标DNA片段：274 bp(沙门氏菌sdiA基因） IAC：3196 bp 引物： SdiA1 ：5`-AAT ATC GCT TCG TAC CAC SdiA2 ：5`-GTA GGT AAA CGA GGA GCA G 使用Pfu DNA聚合酶，产生平末端产物 纯化片段用T4 DNA 连接酶在16℃过夜 续 PCR反应步骤 94 ℃ 1 min 94℃ 20s 52℃ 1min 10-15 cycles 72℃ 30s 94℃ 20s 52℃ 1min 25 cycles 72℃ 3min and 30s 72℃ 10min 第一步循环：扩增小片段DNA（目标DNA） 第二步循环：扩增大片段DAN（IAC） * * * * The detection of food-borne pathogens by PCR is usually performed by means of the following successive (or simultaneous) steps: ? homogenization of the sample; ? (cultural) enrichment of the pathogen under study and sample treatment; ? nucleic acid extraction (optional); ? amplification of nucleic acids from the pathogen under study; ? detection of the amplified DNA from the pathogen under study. Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens: ? General requirements and definitions (ISO 22174) ? Requirements for sample preparation for qualitative detection (ISO 20837) ? Performance testing for