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《兽医传染病学》实验教学指导书 实验内容（16学时） 实验一 鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制（HI）试验（4学时） 目的要求：1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法； 2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。 实验仪器及试剂：八通道微量移液器、单通道微量移液器、96孔V形微量血凝板、恒温箱等。待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。 实验原理： 许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。 实验步骤及注意事项： 一、血凝试验（HA） 取96孔板，按以下步骤操作： 1、第一排1-12孔各加生理盐水25μl，第二排1-12孔加生理盐水25μl为红细胞对照； 2、吸25μl病毒μl至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去25μl，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12。 3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞25μl，微型震荡器震荡2min混匀。 4、室温静置10-30 min，观察结果（见下表）。 5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。 二、血凝抑制试验（HI） 二、血凝抑制试验（HI） （1）根据HA测定的效价，计算配制4个血凝单位（4 HAU）抗原； （2）反应板中，第1孔至第11孔中每孔加入25μlμl PBS； （3）第1孔中加入25μl血清，反应板上将血清横向25μl的对倍稀释至第10孔，弃去25μl； （4）在第1孔至第11孔中，每孔加入25μl的4 HAU抗原，室温下（20~25℃）静置30分钟或2~8℃ 45~60分钟； （5）每孔加入25μl 1%（V/V）鸡红细胞悬液，轻晃混匀后，室温（20~25℃）静置20~40分钟或2~8℃ 45~60分钟，当对照孔的红细胞显著成纽扣状时判定结果。 （6）结果判定 以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数为该血清的HI抗体效价，用2n表示。 复习题与作业： 1. 试举例哪些病毒（不少于三个）对红细胞具有凝集现象？ 2. 撰写实验报告，并对实验结果进行分析总结。 实验二 猪瘟病毒的PCR鉴定（6 学时） 目的要求：1. 掌握RT-PCR技术的基本原理； 2. 掌握猪瘟病毒RNA提取的操作要点。 3. 学会凝胶电泳操作基本方法。 实验仪器及试剂：猪瘟阳性病料、猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒、无水乙醇、微量移液器、DL2000Marker、核酸染料试剂 、三角瓶、琼脂糖、一次性EP手套、烧杯、量筒等。 实验原理： 利用诊断试剂盒中提供的吸附柱提取猪瘟病毒RNA为模板，在反转录酶的作用下，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链；然后在DNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA 片段的扩增带，并以电泳结果初步判断感染情况。 实验步骤及注意事项： 1. 样品采集：病死或扑杀的猪，取扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5 mL，2～8 ℃保存。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。） 2.样品处理： 2.1 组织样品的处理：称取组织0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中，8000 rpm离心2 min，取200 μL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。 2.2 全血样品的处理：待血凝后取200 μL血清于1.5 mL 灭菌离心管中。 2.3 阳性对照的处理：取阳性对照 200 μL于1.5 mL 灭菌离心管中。 2.4 阴性对照的处理：取阴性对照200 μL于1.5 mL 灭菌离心管中。 3. 病毒RNA的提取 3.1 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600μL裂解液，充分颠倒混匀8~10次，室温静置10min 。 3.2 加入600μL异丙醇，上下颠倒混匀5次。 3.3 吸取650μL混合液转入吸附柱，12,000 rpm离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。 3.4 重复步骤3.3。 3.4 向吸附柱中加入600μL洗涤液，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。 3.5 重复步骤3.4 3.6 空柱12,000 rpm 离心2 min。 3.7 将吸附柱移入新的无RNA酶的1