05 菌种的传代与保藏.pptVIP

　　　　　  菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种.微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一项重要的基础工作，是微生物学基础工作的一项重要内容，也是药品微生物工作中的一项常用技术。 如药品中的控制菌检查使用的阳性对照菌须防止因多次传代而使阳性对照菌的典型生物学特征发生变化及菌株的死亡，保证达到菌种长期正确的形态； 　　　如药品微生物学检验过程中，检出的可疑致病菌须妥善保藏，以达到进一步鉴定的目的，保证用药安全。 　　　许多国家都已建立了专门的菌种保藏机构，如美国标准菌种收藏所（ATCC）、英国的国立标准菌种收藏所（NCTC）、还有全球性的世界菌种保藏联合会（WFCC）。  二、菌种代号的意义 国内药品微生物检验所用的菌种代号是 CMCC（F）或 CMCC（B） CMCC —— 中国医学菌种保藏中心 B (Bacteria)代表细菌， F (Fungi)代表真菌。 大肠埃希菌 [CMCC (B) 44102] 乙型副伤寒沙门杆菌 [CMCC (B) 50094] 铜绿假单胞菌 [CMCC (B)10104] 金黄色葡萄球菌 [CMCC (B)26003] 生孢梭菌 [CMCC(B)64941] 枯草芽孢杆菌 [CMCC(B)63501] 短小芽孢杆菌 [CMCC(B)63202] 白色念珠菌 [CMCC(F)98001] 黑曲霉 [CMCC(F)98003] 三、常用菌种保藏方法 (一) 菌种保藏的原理 根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。 低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。 选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用,以提高保藏效果。 （二）菌种保藏步骤 ①挑选特征典型的单个菌落； ②确定保藏的合适菌体形态； ③选择最适宜的保藏方法； ④定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。 1.琼脂斜面低温保存法 （1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸包好，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞，以减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3个月移种一次，继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年至一年，有的甚至更长时间。 （2）适用范围：细菌、霉菌、酵母菌保藏。 黑曲霉改良马丁琼脂斜面不同培养时间的生长形态 黑曲霉改良马丁琼脂斜面典型斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。黑曲霉孢子相当稳定，可以保存于4 ℃0.9%氯化钠溶液中较长时间，作为孢子悬液储备液使用。由此可以减少菌液制备工作量和反复操作黑曲霉的风险。 各类菌种保藏条件及时间 （4）注意事项： 实验用的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。 生孢梭菌可用庖肉培养基或硫乙醇酸盐流体培养基（前者效果更佳）。 必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。 每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。 保藏菌种的培养基应无糖，若含糖，一般小于 2 %为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。 保藏温度和时间都不是绝对的，个别菌种不宜低温保存。如铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。  2、液体石蜡保存法： 本法是用液体石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。 （1）方法： 将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~ 0.5 %琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。 取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，加塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或 110~ 170 ℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的水分。 将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端 1 ㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。 适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放