白细胞介素-10对人牙囊细胞RANKL表达影响.docVIP

白细胞介素-10对人牙囊细胞RANKL表达影响[摘要]目的：研究人牙囊细胞白细胞介素－10(interleukin－10，IL－1O)蛋白的表达及其对破骨细胞分化因子(receptor act．-vator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)表达的影响。方法：采用组织块加胶原酶消化法培养人牙囊细胞，进行IL－10免疫组化染色。25ng／mlIL-10作用于牙囊细胞O、1、3、6 h，用RT―PeR检测RANKL mRNA表达的变化。结果：人牙囊细胞IL－1O表达阳性。25ng／ml IL-1O降低人牙囊细胞RANKL的表达，且具有时间依赖性。结论：人牙囊细胞表达IL－10，IL－10通过降低人牙囊细胞RANKL的表达，在牙齿萌出过程中起重要的调控作用。 [关键词]人牙囊细胞；白细胞介素－1O；破骨细胞分化因子 [中图分类号]R783 [文献标识码]A [文章编号]1008―6455(2007)02一02 34―03 牙囊是一层包绕未萌出牙齿的纤维囊性结缔组织，牙囊细胞通过参与破骨作用使牙槽骨吸收，进而形成牙齿萌出道，在牙齿萌出过程中发挥着关键作用。这一过程受到许多因子的调控，其中骨保护素(osteoprotegerin，OPG)和破骨细胞分化因子(RANKIJ)是直接控制破骨细胞形成和分化的功能因子。白细胞介素10(IL-IO)是一种炎症抑制因子，具有抑制破骨的作用。研究表明它能够抑制牙槽骨的破骨细胞性骨吸收。本实验研究体外培养的人牙囊细胞IL-IO蛋白的表达及其对RANKL表达的影响，进一步探讨牙齿萌出的机制。 1材料和方法 1．1实验材料：DMEM培养液(Hyclone，uSA)，胎牛血清(Gibco，USA)，兔抗人IL-10多克隆抗体(Santa Cruz，USA)，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(Santa Cruz，USA)，IL-IO(Pepro Tech，USA)，TRIzol Reagent(Invitrogen，USA)，逆转录试剂盒(Invitrogen，USA)。 1．2人牙囊细胞的体外培养与鉴定：取12～16岁因正畸需要拔除的下颌第三磨牙的牙囊组织，采用组织块加胶原酶消化法培养人牙囊细胞。细胞抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性，表明细胞来源于外胚问充质，无牙源性上皮混杂。取第5代人牙囊细胞进行实验。 1．3人牙囊细胞中IL-IO的免疫组化染色：取生长状态良好的第5代人牙囊细胞进行爬片。细胞爬片用4％多聚甲醛固定lOmin，然后用PBS振洗5min×3次。0．3％的TritonX-100滴在爬片上lOmin，增加细胞通透性；然后滴加3％H202 lOmin，阻断内源性过氧化物酶；滴加10％羊血清封闭30min；不洗，滴加兔抗人IL-IO多克隆抗体后置入湿盒4℃过夜，空白对照组滴加PBS；次日在37℃温箱复温1h，滴加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体，置入37℃温箱lh；以上每步之后用PBS振洗5min×3次，然后DAB显色5～l0min。苏木素复染，逐级脱水，透明，中性树胶封片。 1．4RT-PCR检测IL－10对人牙囊细胞RANKL表达的影响：取生长状态良好的第5代人牙囊细胞，在终浓度为25ng／m1 IL-IO作用下分别于0、1、3、6h收获细胞。用TRIzol Reagent提取细胞总RNA。取2℃总RNA用逆转录试剂盒完成cDNA第一链的合成，然后进行PCR扩增。RANKL引物序列：上游引物：5GGCTCATGGTTAGATCTGGC-3’： 下游引物：5TGACCAATACTTGGTGCTTCC-3’；该引物产生351bp的eDNA片段。GAPDH引物序列：上游引物：5GCTCTCCAGAACATCTACC-3’；下游引物：5GTGTCGCTGTTGAAGTCAG-3’；该引物产生266bp的eDNA片段。引物由上海生物工程公司合成。反应条件为：RANKL 94℃预变性2min：94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸lOmin。GAPDH 94℃ C预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸lOmin。PCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪下观察，凝胶图像分析系统成像。计算RANKL与GAPDH的灰度值之比，用来评定RANKL的相对表达量。以上实验重复进行3次。统计分析采用SPSSIO．0软件进行单因素方差分析(P＜O．05)，认为有显著性差异。 2结果 2．1人牙囊细胞中IL-IO的表达：人牙囊细胞中IL―10表达阳性，胞质呈棕褐色，空白对照组表达阴性(如图1)。 2．2 IL