猪皮肤撕脱伤CD18表达及组织继发性坏死探究.docVIP

猪皮肤撕脱伤CD18表达及组织继发性坏死探究[摘要]目的：研究猪皮肤撕脱伤组织中整合素CD18的表达及中性粒细胞的趋化，探讨CD18在皮肤撕脱伤组织继发性坏死中的作用。方法：复制猪皮肤撕脱伤模型，采用RT-PCR方法检测伤后不同时间撕脱组织中CD18mRNA的表达；用髓过氧化酶(MyeloperoxidaBe enzyme，MPO)法测定组织中中性粒细胞数量，研究伤后撕脱组织中中性粒细胞的趋化情况。结果： ①伤后撕脱组织中CD18mRNA的表达逐渐升高，12h达峰值，24h后有所下降，受伤2h后各时间点实验组CD18mRNA的表达明显高于对照组（P 1.3 组织中CD18mRNA的表达：采用RT-PCR 法检测组织标本中CD18mRNA的表达，用 Trizol 试剂（Gibco-BRL公司）分别提取实验组和对照组组织标本中的总 RNA，用随机引物将其反转录成 cDNA 后进行 PCR 扩增，并以β-Actin为内对照。其中扩增CD18基因的上游引物为5’ TTTAgAAgAACAACCCgTgC 3’；下游引物为：5’ TgTTgATgCTggACgTgCAC 3’；PCR 条件为：94℃30 s，55℃60 s，72℃60 s，30个循环。反转录按照试剂盒（Promega公司）提供的说明书进行，其中CD18的扩增片断为500bp，β-Actin的扩增片断为250bp, 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，用UVP凝胶成像系统进行检测，并用Labworks软件对各阳性条带的密度进行测定。利用PCR胶回收试剂盒（上海华舜生物技术公司）将PCR产物从凝胶上收回，进一步亚克隆至PMD18-T载体，经转化JM109感受态细胞、筛选、小量制备质粒DNA后，用Sanger双脱氧链终止法及测序试剂盒(Amer-sham)进行序列测定。 1.4 组织中MPO活性测定：取撕脱组织0.1g，加入0.5%溴代十六烷基三甲胺（Sigma公司）溶液2ml，用匀浆机（德国ART公司）匀浆。超声细胞粉碎仪（英国SANYO MSE公司），（10s、3次）粉碎细胞及亚细胞成分。0～4℃，40000g离心15min。取上清0.1ml加反应液2.9ml（磷酸邻联茴香胺16.7mg，50mmol/LPBS液10ml，蒸馏水90ml，加入30%过氧化氢，使最终浓度为0.0005%），分光光度计（HITACHI公司）460μm波长下立即进行2min扫描。以第30s至90s 1min时间内吸光度(OD值)的变化代表酶活力的改变。根据下列公式计算MPO活性单位（25°C下，每分钟分解1μmolH2O2的MPO的量为1个MPO活性单位)，以反映组织中中性粒细胞的浸润数量。MPO活性单位（×103U）/kg=（ΔA460/min）÷（11.3×所加组织量/L反应液）。 1.5 统计学处理：实验结果均以均数±标准差表示，采用SPSS10.0统计软件t检验对实验数据进行统计分析。 2结果 2.1组织中CD18mRNA的表达：凝胶电泳结果显示实验组与对照组各时间点均有阳性条带，PCR产物从凝胶上回收扩增后，序列测定显示为整合素CD18的cDNA。利用Labworks软件对各阳性条带进行分析，结果显示：两组各阳性条带的灰度值存在差异，而内参照β-Actin的表达两组间没有差异(图1)，两组CD18 mRNA的表达均随时间推移而逐渐升高，至12h达峰值，此后略有下降，撕脱2h后实验组各时间点CD18 mRNA的表达明显高于对照组（图2） (P [2]Demirseren ME, Sarici M, Gokrem S, et al.Protective effects of monoclonal antibody to intercellular adhesion molecule-1 in venous ischemia-reperfusion injury: experimental study in rats[J]. J Reconstr Microsurg, 2007,23(1):41-44. [3]李向东,鲁开化, 郭树忠,等. 皮肤撕脱伤实验动物模型建立与实验的报告[J]. 中国美容医学, 2001, 10(2):103-104. [4]季红星, 郭树忠, 鲁开化. 可溶性E-选择素分子在猪皮肤撕脱伤血浆中的表达[J]. 中国美容医学, 2001,10(4):289-290. [5]李向东, 鲁开化, 郭树忠, 等. 药物局部治疗对猪皮肤撕脱伤后TXA2/PGI2变化的影响[J].第四军医大学学报, 1999, 20(11):929-931. [6]Lau D, Mollnau