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 研究差异表达基因的相关技术 基因的差异表达？ 高等真核生物的基因组一般含有数万个基因，而每一个细胞大约只表达其中的15%。 基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达决定了生命活动的多样性，如发育与分化、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调控等。比较细胞间基因表达的差异为我们揭示生命活动的规律提供了依据。 第一节 概述 一、研究差异表达基因的目的和意义 目的： 一是筛选与疾病发生相关的功能基因； 二是作为功能基因组学的一部分内容，深入研究基因组中所有基因的功能。 意义 从基因水平揭示疾病的发生机制，探索治疗疾病的有效方法。 1.同时显示和研究多个基因在细胞正常和异常状态下的表达水平 差异显示反转录PCR技术 DDRT-PCR Differential display RT-PCR 消减杂交技术 SH Subtractive hybridization 2.同时展示细胞在特定状态下的表达图谱，又能显示哪些差异表达的基因 基因芯片技术 DNA chip 基因表达系列分析 SAGE Serial analysis of gene expression 二、研究差异表达基因的主要方法 筛选差异表达基因有2个层次： mRNA protein （一）基因芯片技术 DNA chip cDNA微阵列杂交技术 cDNA microarray hybridization （二）基因表达的系列分析 SAGE serial analysis of gene expression SAGE技术由Dr. Kinzler 在1995发表 (Science 270:484-487)，是近几年来发展起来的一种快速分析基因表达信息的技术。 SAGE技术的理论基础 首先，一段来自于任一转录本特定区域的“标签” (Tag)，即长度仅10～14bp的短核苷酸序列，就已包含了足够的信息以特异性地确定该转录本。 例如：一个10碱基的序列能有410=1048576种不同的排列组合，而人类基因组据估计仅编码80000种转录本，因此在理论上每一个10碱基标签就能够代表一种转录本的特征序列。 从mRNA (transcript)某一特定位置分离一段9~10bp的寡核苷酸序列标签(sequence tag，ST) 9bp片段可区分262144种mRNA 双标签序列(ditig)，锚定酶(anchoring enzyme,AE)，标签酶(tagging enzyme,TE) 多联体克隆到一个载体中 多联体进行序列分析 计算机处理，确定每一种序列(ST)代表转录产物的种类和出现频率 1. 将5μg含有oligo dT（引物）的磁珠与RNA混合。? 2. 合成双链cDNA。? 3. 用NlaⅢ酶（AE）消化形成一条链末端有标记的产物。? 4. 将样品分成两份，连接成含有标签酶识别序列的产物，以备用BsmF1（TE）消化。 5. 用BsmFⅠ切割每一个样品形成50bp的标签。 6. 混合2个反应体系，延伸5秒，连接成100bp的双链标签。? 7. PCR扩增。 8. 用NlaⅢ酶切40bp产物释放26bp双链标签。 9. 连接片断形成串联体。? 10. 克隆到pZErO-1+里，并测序。 Example of a concatemer: CATGACCCACGAGCAGGGTACGATGAT- TAG 1 TAG 2 CATGGAAACCTATGCACCTTGGGTAGCA-  TAG 3 TAG 4 CATGTAGGACGAGGGTGGACAATGCTCATG  TAG 5 TAG 6 相关技术的比较 SAGE技术的应用 正常细胞或组织基因表达谱研究 疾病相关基因表达研究 染色体表达图谱绘制 基因功能研究 药物作用机制的研究 毒理学研究 寻找新的基因 SAGE技术的优点和缺点 较全面获取生物的基因表达信息， 对基因序列没有选择性 所需的样品量极少 (100 ng mRNA) SAGE技术具有较好的重复性 发现新基因 设备简单 同表达谱芯片技术具有互补性和挑战性 成本较高，方法较复杂 10 bp序列表征基因尚有缺陷 SAGE技术的发展 鉴于SAGE文库中的Tag序列仅10个碱基，即使加上4个碱基的特定锚定酶切位点也就共14个碱基，在实际研究工作中其特异性尚有欠缺、包含的信息量较少，不便于后续工作，因此其相应的补充性、改良性技术也颇引人注目：