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定量PCR实验要素和数据处理 张 庆 Application Specialist Molecular Cellular Biology 定量PCR的实验要素 2 定量PCR实验要素 目标基因 样品 标准曲线 标准品 监控系统故障 阳性对照 监控污染 阴性对照 校准生物学误差 阳性内对照 (IPC) 校准物理误差 参比荧光 (ROX) 降低其余误差 重复实验 3 样 品 DNA纯度： OD /OD =1.8，1.6-2.0之间 260 280 DNA用量： 0.05 ng – 100 ng RNA纯度： OD /OD =2.0 260 280 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL 标准品 目的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的线性关系 要求： 浓度已知 5点以上 标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100% 仪器质量一致 试剂质量一致：模板纯度、引物和探针的Tm值、酶活性、 缓冲液成分 反应条件一致：循环参数相同、同一次实验 不要求： 不要求标准品与目标基因使用相同的DNA CT = - k lgX0 + b 标准品梯度稀释方法 选择目标→提取/PCR →纯化→测定浓度→调整浓度→梯度稀释 CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间 10倍连续梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v 标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 切不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准 品ii、iii、iv、v 标准品单位 标准品的单位决定定量结果的单位 根据最终目的选择标准品单位 如果要求测定样品的基因拷贝数，则梯度稀释已 知摩尔浓度的DNA片段 如果要求测定样品的重量百分比[%(w/w)]，如转 基因，标准品是将转基因与非转基因食品粉末按 重量比混合，然后抽提混合DNA；切不可先抽好转 基因DNA，再梯度稀释，也不可分别抽提转基因与 非转基因DNA，再按重量比例混合（这样得出的是 基因重量百分比，而不是样品重量百分比） PCR理论方程 n N-产物分子数；N -起始分子数 N = N x (1+e)