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VEGF在犬恒牙胚发育中表达及意义[摘要]目的：探讨犬乳恒牙替换过程中血管内皮生长因子(VEGF)在犬恒牙胚发育中的表达及意义。方法：分别对乳牙期、替牙期、恒牙期本地犬取牙胚及其周围组织，制备石蜡切片，进行HE染色和牙胚内VEGF的免疫组化染色，用彩色病理图像分析系统分析各组染色强度灰度值。结果：乳牙期、替牙期犬牙胚的成牙本质细胞VEGF的免疫组化强度明显高于另外一组，成釉细胞中也有阳性信号。结论：VEGF可能参与恒牙胚的发育。 [关键词]犬恒牙胚；血管内皮生长因子；成牙本质细胞；成釉细胞 [中图分类号]R780.2 [文献标识码]A [文章编号]1008―6455(2007)04―0510―02 血管内皮生长因子(Vascular EndothelialGrowth Factor，VEGF)是由血小板、巨核细胞、内皮细胞和成骨细胞或肿瘤细胞合成和分泌的多功能细胞素，具有促进内皮细胞增殖、血管生成、增加血管通透性以及血管维持等功能。许多研究表明，VEGF在胚胎发育过程中协调着细胞外基质的改建、血管增生的关系。而在恒牙胚发育中的作用却未见相关报道。本实验主要通过对犬恒牙胚成牙本质细胞中VEGF的表达进行研究，探讨VEGF在此过程中的作用。 1　材料和方法 1．1　材料及分组：动物选用本地犬共6只，分为3组，每组各2只。A组：乳牙牙根稳定犬(6周龄)，体重2.5Kg；B组：乳牙牙根吸收犬(12～16周龄)，体重6Kg；C组：成年恒牙列犬(20周龄)，体重10Kg。 1．2 试剂：兔抗鼠和人VEGF多克隆抗体(SantaCruz公司，美国)；SABC免疫组化检测试剂盒(北京中杉)；DAB显色试剂盒(北京中杉)。 1．3 切片标本制作及观察：分别将实验犬以速眠新Ⅱ注射液按0.2ml/Kg肌注麻醉，解剖分离双侧颈动脉后断头处死，颈动脉插管，用生理盐水冲洗，4％甲醛固定液(含1/1000 DEPC)进行灌注组织内固定，分离上、下颌骨，4％甲醛固定液外固定24h，上、下颌骨于甲酸、甲酸钠脱钙液中4℃脱钙，4周后分切成小块，再脱钙4周。脱钙后，分切、修整、酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，制作5μm厚石蜡切片。石蜡切片脱蜡至水，常规HF染色，每只犬取5张切片共30张，每张切片光学显微镜下观察根尖组织。 1．4 免疫组化染色及图像分析：切片脱蜡至水，一抗为兔源性抗体，稀释度1：80，其余步骤按试剂盒进行。用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统分析染色强度的灰度值，每个时期10张切片，每张切片随机选取4个成牙本质细胞进行测量。 2 结果 A组：8周犬乳牙根未发生生理性根吸收，恒牙胚牙冠发育处于牙体组织形成期，牙本质、牙釉质基质开始形成。成釉细胞、成牙本质细胞高柱状，胞核椭圆形，远离基底膜，整齐排列，极性倒置明显。此时可见恒牙胚内成牙本质细胞及成釉细胞染色阳性，染棕黄色。空白对照组染色阴性。B组：12～16周犬乳牙根发生生理性吸收，恒牙胚冠部牙本质、牙釉质进一步形成和矿化，成釉器萎缩、上皮根鞘向根方生长，形成上皮隔，并可见上皮根鞘发生断裂。此时恒牙胚内成牙本质细胞及成釉细胞染色阳性，空白对照组染色阴性。C组：20周成年犬恒牙列，乳牙已脱落，恒牙萌出。恒牙成牙本质细胞染色阴性。 经彩色病理图像分析系统分析，成牙本质细胞染色灰度值分析见表1。 经LSD检验，A、B组与C组间P＜0.05，即成牙本质细胞免疫组化染色强度A、B组与C组间有显著性差异，说明成牙本质细胞表达VEGF的强度不同。A组与B组间P＞0.05，即成牙本质细胞免疫组化染色强度A组与B组间无显著性差异。 3　讨论 VEGF的研究始于1989年，VEGF是一种由亚基内及亚基间二硫键交联形成的同源二聚体糖蛋白。目前已发现VEGF家族至少包括五大成员：VEGF―A、VEGF―B、VEGF－C、VEGF-D并口PGF(placentalgrowth factor，胎盘生长因子)，分别定位于不同的染色体。目前已知VEGF家族有3个受体：VEGFR―1、VEGFR―2、VEGFR－3，分别由f1t―1、f1k―1/KDR、f1t一4基因编码。其共同特点是催化域内有酪氨酸激酶插入区，酪氨酸激酶的活性通过受体和配体结合而激活，由受体磷酸化而刺激蛋白酶和Ca离子内流，对细胞的生长和分化起重要作用。 研究表明，VEGF是内皮细胞特异性最强的丝裂原，具有特异性促进血管增殖的作用。在牙齿发育早期，内皮细胞分泌VEGF促进血管形成。大量血管侵入牙乳头、牙囊，以保证组织形成所需的营养。Aida研究表明，VEGF表达于内、外釉上皮及星网层细胞，调控成釉细胞的成熟。当成釉细胞成熟后，对牙乳头发生诱导作用，分化为成牙本