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TCRVβ7.1重组腺病毒载体构建【摘要】 将TCRVβ7.1基因克隆入腺病毒穿梭质粒pDC315中，再穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞，包装出重组腺病毒。然后用PCR，RT-PCR对其进行鉴定。 【关键词】 TCR；重组腺病毒载体；TCRVβ7.1 能够特异识别抗原肽-MHC复合物的T 细胞受体(T cell antigen receptor ,TCR)，在肿瘤抗原的识别及杀伤过程中具有重要作用[1,2]，将肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转染T细胞用于杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的方法之一[3]。在以往实验中发现转染TCRVβ7.1基因的T细胞对肝癌细胞株BEL-7402[4]杀伤活性明显提高，由于脂质体的转染率较低和毒性较大，现构建重组腺病毒载体Ad.TCRVβ7.1，以提高转染率和降低毒性。 1材料与方法 1.1质粒、菌株和细胞 AdMaxTM 腺病毒包装系统(腺病毒骨架质粒、腺病毒穿梭质粒pDC315、HEK293细胞)购自加拿大Microbix公司；PBMC从人血分离；质粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela（宫颈癌细胞）及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。 1.2试剂 限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒及DNA Mark购自Takara公司。Lipofectamine2000和Trizol购自Invetrogen公司。质粒提取及胶回收试剂盒均购自Omega公司。淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司。 1.3穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1的构建 穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1构建过程如（图1）。设计一对带有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物，PCR产物双酶切后连接到穿梭质粒pDC315中，得到腺病毒穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1。 图1 穿梭质粒pDC315Vβ7.1的构建 1.4重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包装 接种4×105个低代的HEK293细胞于六孔板中，约24h后细胞密度达到60%～80%时，用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒和骨架质粒共转染293细胞。待细胞长满培养板时，将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养。约细胞转染10～14d时，可观察到病毒病变斑出现。继续培养1到2天使病变斑扩大，1000g离心5min收集细胞，将细胞于-80℃和37℃反复冻融3次后，1000g离心10min，上清即为初次收获的病毒液。 1.5重组腺病毒AdTCRVβ7.1的鉴定 用病毒核酸提取试剂盒抽提收获病毒基因组DNA，PCR检测，鉴定重组病毒是否含有目的基因。用收获的病毒液感染Hela细胞，抽提细胞总RNA，RT-PCR检测目的基因是否表达。 2结果 2.1重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的PCR鉴定 用脂质体Lipofectamine2000将构建好的穿梭质粒和骨架质粒共转染HEK293细胞，待细胞病变后，离心收获病毒上清。用病毒核酸提取试剂盒提取上清中病毒基因组DNA，用构建时所用的引物做PCR，琼脂糖电泳检测可见条带942bp，与 TCRV β7.1基因相符（图2）。 图2 重组腺病毒AD.TCRVβ7.1的PCR鉴定 M:DL2000 DNA markA:TCRVβ7.1PCR 扩增产物 2.2重组腺病毒Ad.TCR Vβ7.1的RT-PCR鉴定 用重组腺病毒Ad.Vβ7.1感染HELA细胞后，48小时提取总RNA，用构建时所用的引物做RT-PCR，可检测到目的基因TCRVβ7.1的表达（图3）。 图3 重组腺病毒AD.Vβ7.1的RT-PCR鉴定 M:DL2000DNAmarker A:TCRVβ7.1RT-PCR 扩增产物 讨论 将识别肿瘤特异性抗原的TCRVβ7.1基因[4]转入健康人外周血淋巴细胞，再将产生抗肿瘤效应细胞毒T细胞（Cytolytic T Lymphocyte，CTL）回输给患者，其属于过继免疫治疗[5-6]。由于目前主要采用脂质体作为转染途径，较低的转染率已经成为限制其发展的瓶颈。为了解决这个问题选用了腺病毒载体，它具有以下优点：插入DNA 链较长；病毒滴度高；对细胞的感染率高；宿主范围广,安全性高，其已成为目前基因免疫治疗最常用的载体。成功的构建了重组腺病毒Ad.TVβ7.1，获得了较高的滴度，为后续的研究奠定了坚实的基础。 参考文献(References) [1]黄树林,陈维春,林月霞等.TCRVβ7.1基因家族的优势取 用和PTK信号传导途径的激活及体外对肝癌细胞凋亡的 诱导[J].中国免疫学杂志,2001，