SD大鼠糖尿病创面及正常创面中TGF-β1、TGF-β3表达差异.docVIP

SD大鼠糖尿病创面及正常创面中TGF-β1、TGF-β3表达差异徐　蓉　范　斌　徐文彬　金　伟　肖秀丽　王一飞 [摘要]目的：通过观察大鼠正常创面与糖尿病模型创面肉芽组织中／GF－β1、TGF－β3不同时段表达水平的差异，探求糖尿病创面“难愈”的可能机制。方法：采用SD大鼠实验性正常创面及糖尿病创面背部全层皮肤缺损模型，分别于不同时段(3天、7天、11天)取材，EnVision二步法免疫组化测定，并行图像扫描定量分析TGF-β1、TGF-β3水平变化。结果：创伤后3天、7天和11天，正常创面模型组TGF-β1表达分别为(25．56±6．86)、(24．79±5．62)和(28．57±6．39)，TGF-β3表达分别为(39．69±5．46)、(23．20±2．45)、(13．69±3．63)。而糖尿病溃疡模型组TGF-β1表达分别为(7．10±3．74)、(9．47±1．72)和(7．87±2．53)，TGF-β3表达分别为(14．99±1．87)、(18．72±5．01)和(8．68±3．39)。糖尿性创面肉芽组织中各时段(3天、7天和11天)TGP-β1及TGF-β3表达水平均低于正常创面组(P＜0．05)。结论：SD大鼠糖尿病创面TGF-β1及TGF-β3的低水平表达，可能是创面愈合迟缓的原因之一。 [关键词]糖尿病：创面愈合；TGFβ [中图分类号]R641　[文献标识码]A　[文章编号]1008―6455(2007)01―0035－03 TGF－β是参与创面愈合全过程的重要因子，近来有国?外研究表明：创面难以愈合往往和生长因子的缺乏有关。我们以SD大鼠实验性正常创面与糖尿病溃疡模型为研究平台，动态观察不同时段新生肉芽组织中TGF－β1、TGF－β3水平的变化，从生长因子水平阐明糖尿病性创面的部分机制。 1　材料和方法 1．1实验动物及分组：48只清洁级SD(sprague-dawly)大鼠，雄性，质量(250±20)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(批号医动字第04-20-3号)。糖尿病造模后随机分为3天、7天和11天三个观测时段。每个时段又分为正常创面生理盐水组、糖尿病创面生理盐水组。每组各8只动物。 1．1．1主要实验试剂和仪器 1．1．2大鼠创面模型制备用药：新洁尔灭酊，0．9％生理盐水(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院提供)。0．1％盐酸氯胺酮(上海中西药业股份公司产品)。四氧嘧啶(Auoxan)，试剂编号：2244-11-3。瑞士FULKA公司产品(由上海中医药大学药理毒性实验室提供)。罗氏ACCU-CHEK ACTIVE血糖仪和血糖测试试纸，编号：2005―10瑞士Roche公司产品。 1．1．3免疫组化试剂和仪器：转化生长因子β1多克隆抗体，工作浓度1：200；转化生长因子β3多克隆抗体，工作浓度1：200，均为北京中山生物工程公司产品；二抗抗体(生物素标记的羊抗兔抗体)，工作浓度1：200，美国Vector公司产品。EnVision试剂盒，工作浓度1：100，日本DAKO公司产品。3，3-二氨基联苯胺(DAB)，瑞士Fluke公司产品；BX51／BX52系统显微镜，日本Olympus公司产品。SX-100计算机图像分析系统，美国IBM公司产品。 1．2方法 1．2．1动物实验(上海中医药大学岳阳中西医结合医院动物实验室) 1．2．2糖尿病大鼠模型制备：糖尿病大鼠模型制备参照傅小兵等方法改进动物随机分为对照组和实验组，禁食24h后(饮水不限)，分别在乙醚麻醉下尾静脉一注射1．5％四氧嘧啶(50mg／kg，实验组)及等体积生理盐水(对照组)，造模后4h后给予5％葡萄糖水溶液饮用，次日经尾部取血测血糖，血糖值大于10mmol／L上，则表明造模成功。模型制成后，实验组再随机分三组，每三天测血糖一次，直到动物处死。 1．2．3动物糖尿病创面造模：糖尿病大鼠模型制造完成后三天，参照傅小兵等方法改进，SD大鼠用1％盐酸氯胺酮(0．3ml／100g)腹腔注射麻醉。局部备皮，常规消毒后，于SD大鼠背部取直径为3cm左右圆形切口，剪开皮肤全层，至皮下筋膜，无菌敷料加盖，每日换料一次。 1．2．4动物标本采取：用药后第3天、7天、11天，将动物麻醉(氯胺酮)处死，用眼科手术剪分离新生创面肉芽组织，并成块取下，为所需实验样品。 1．2．5免疫组化实验：(上海复旦大学肿瘤医院病理实验室和上海中医药大学药理毒性实验室)6组(3个?段，每个时段分2组)标本均用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，每例分别进行HE染色。(用以对照病理诊断)，并同时、同一试剂进行免疫组化EnVision二步法测定／FGβ1、TGF