计算机在生命科学中应用第四次作业2.docVIP

对硫矿硫化叶菌的一段未知功能蛋白的基因进行引物设计 前言： PCR技术的的运用，要点包括三部分，模板、引物和体系。模板是扩增的基础，引物是PCR技术的关键点，在现在实验条件下，模板和体系一般都有商品化的技术支持，因此，能否设计出好的引物就成了PCR反映的关键 1.利用软件Vector NTI Explore 对硫矿硫化叶菌DNA序列进行酶切找到含目的基因的较小的片段 2.利用软件Vector NTI Explore进行引物设计引物 Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）的一段DNA 序列。 3. 引物设计的原则： （1）长度在18~35bp，GC含量在40%~60%之间，内部无发卡结构，Tm值接近72℃； （2）引物之间避免形成二聚体； （3）引物3’端和模板之间不应少于12个连续碱基相匹配； （4）在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片断；有时需要在引物的3’端加上适当的酶切位点。 （5）引物3′端不能选择A，最好选择T。 （6）引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 实验内容： 试验中用到的古生菌的序列长12389bp，其中80-709bp是要得到的未知功能蛋白质的基因序列，利用Vector NTI Explorer分析酶切位点，依次用 PStI、EcoRI和ClaI处理，在使用另一种酶处理之前，先用琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段，最后得到1——1429的DNA片段，是理想的PCR模板。再次使用Vector NTI Explorer分析，设计PCR引物，使用PCR扩增得到目的DNA。 实验步骤： 1, 要用限制性内切酶将多余的片段切去。找出目的基因所在的片段 这是Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）DNA序列利用软件Vector NTI所能找到的所有酶切位点： 由给出的切割位点课已看出，在整条基因序列中PstI的切割微点只有一个，所以首先用此限制酶切割，可以得到3370bp之前的整条片段。这样做既不会切断需要的那一段基因序列，又可以切除掉大部分的不需要的片段。切完后，进行琼脂糖凝胶电泳法进行电泳，可以得到下图： 在电泳过程中，DNA片段越大就跑的越慢，因为需要的是含有80-709bp的那一段，因此应当回收跑的快的那一段，即1-3370bp这一段 在电泳过程中，DNA片段越大就跑的越慢，因为需要的是含有80-709bp的那一段，因此应当回收跑的快的那一段，即1-3370bp这一段 得到1-3370bp这一段基因序列后如果再次进行切割，那么所有的酶切位点如上图所示。未得到80-709bp片段就可以用EcoRI酶进行完全切割，这样可以得到1-1429bp、1429-2696bp、2696-3259bp、3259-3370bp这四个片段，长度为1429bp、1267bp、563bp、111bp，若为这样那么前两段长度相差很小，电泳时不易区分，于是要用ClaI 得到1-3370bp这一段基因序列后如果再次进行切割，那么所有的酶切位点如上图所示。未得到80-709bp片段就可以用EcoRI酶进行完全切割，这样可以得到1-1429bp、1429-2696bp、2696-3259bp、3259-3370bp这四个片段，长度为1429bp、1267bp、563bp、111bp，若为这样那么前两段长度相差很小，电泳时不易区分，于是要用ClaI进行双酶切隔。将1429-2696bp段再切为两段，长度分别为943bp、342bp，这样点勇士便于区分。可以比较容易的得到目的片段，即1-1429bp段。电泳如左图： 同理可将1429bp处的电泳条带中的DNA序列取出，回收里面的DNA,这就是含有目的基因的DNA序列。这一段序列就有一个酶切位点AvaI，如图。用工具找它的ORF，ORF的分析结80~709bp处， 1 AAAATCTTCC AATTATTTCA GTAGTGTCTA TCTTTTAATA TGAAAAATTT TTGATGTTTT AGTTTGAAAA ATTTATTAAG TGAGAAAACA ACTCTCTATT TTTTAGAAGG TTAATAAAGT CATCACAGAT AGAAAATTAT ACTTTTTAAA AACTACAAAA TCAAACTTTT TAAATAATTC ACTCTTTTGT TGAGAGATAA 101 GGAATGAAGA ATCTTTATAA AATTAACTTT TCAATATCAC ACCAAGGTTG CTGGACCAGC AAAATAAAAG ATAGTGTTGT TACCTTAAAT G