实验一质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测.docVIP

实验掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法 掌握限制性内切酶酶切DNA的操作过程 掌握琼脂糖电泳的原理和方法 凝胶成像仪TAE,核酸染料，DNA Marker(DL2000，λ-Hind III digest DNA Marker), EcoR I内切酶等。 四、实验操作 1. 质粒提取 （1）挑取单菌落至3 mL LB液体培养基，37摇动（200 rpm）培养过夜。（）转移菌液至1.5 mL Eppendorf管中，12000 rpm离心45 sec，尽量弃尽上清。 （）加入250 ( 预冷的I(请先检查是否加入RNaseA)，充分悬浮，静置2 min。注意：如果有未彻底悬浮的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度的偏低。 （）（）（）（）（）（） （）（）（12）利用分光光度计对提取的pGEX-4-T质粒DNA进行定量测定。 （13）取3 μL 提取的质粒DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测。 （1）-20保存。按以下酶切反应体系酶切质粒pET-28a： 10×H Buffer 2 μL ddH2O μL EcoR I 1 μL pET-28a 10 μL（≤1μg） Total 20 μL 酶切反应条件：37下酶切 h，用%琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果。 1% 琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖, 置于试剂瓶中，加入30 mL 0.5× TAE工作液，将该试剂瓶置于微波炉加热直至琼脂溶解。 （2）胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净，晾干，放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液倒入30mL 于小烧杯中，加入1.2μL的核酸染料（Gold view），轻轻摇匀，小心地倒在有机玻璃内槽上，使胶液慢慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下放置30 min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，这时在胶板上刚形成相互隔开的上样孔。待用时，将铺好胶的有机玻璃内槽放入含有电泳缓冲液TAE的电泳槽中备用。 （3）加样：将样品4ul与上样液（6X）1ul混合后，用微量加样器将上述样品加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面，样品孔容量约为10 (L左右。 （4）电泳：加完样后的凝胶板可以通电进行电泳。建议在80-100V的电压或20 mA下电泳。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1.5 cm时，停止电泳。 （5） 染色、观察和拍照：在紫外灯下观察凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。在紫外灯下观察时．应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。采用凝胶成像系统拍摄电泳带谱，并作结果分析。 五、结果分析 如图所示，泳道顺序为大Marker、非酶切样品、酶切样品、非酶切样品、酶切样品、非酶切样品、酶切样品、非酶切样品、酶切样品、小Marker。本实验为单酶切反应，酶切前后DNA分子大小不变，构型由超螺旋环状结构变为线状结构。图中非酶切样品跑在酶切样品前面，因为非酶切样品的超螺旋环状结构在电泳中的移动速率大于酶切样品的线性结构。后三组出现明显的拖尾现象，可能是结构被破坏，分子杂质含量高等原因。