TaqMan荧光定量RTPCR检测水稻RAc1基因mRNA方法的建立.pdf

云 南 植 物 研 究　2009 , 31 ( 1) : 75～81 DOI : 103724SPJ 1143200908142 Acta Botanica Yunnanica 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 TaqMan 荧光定量 RTPCR 检测水稻 RAc 1 基因 mRNA 方法的建立 高 　东 , 王云月 , 何霞红 , 李成云 , 朱有勇 ( 云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程研究中心 , 农业生物多样性和控制病虫害 教育部重点实验室 , 云南省植物病理重点实验室 , 云南 昆明　650201) 摘要 : 构建包含 RAc1 基因 cDNA 片段的质粒 , 作为水稻肌动蛋白基因 RAc1 之 mRNA 定量检测的标准品 , 建立检测方法 , 为水稻其他基因的定量建立内参 。从水稻叶总 RNA 中逆转录扩增总 cDNA , PCR 扩增 RAc1 基因中设计的目的片段 , 将纯化的目的片段与pMD19T Simple 载体进行连接 , 转化宿主菌JM109 , 提取重 组质粒 DNA , PCR 鉴定并测序分析 。纯化质粒并检测 260 nm 吸光值 , 确定重组质粒原液的拷贝浓度并以 此制备荧光定量 PCR 梯度浓度标准品 , 进行实时荧光定量 PCR 实验 。建立了 RAc1 基因 mRNA 表达实时荧 2 2 7 ( ) 光定量 PCR 检测方法 , 特异性好 , 检测灵敏度达 10 拷贝 , 线性范围为 10 ～10 拷贝 , 阈值循环数 Ct 与 PCR 体系中起始模板量的对数值之间有着 良好的线性关系 (r = 1000) , 扩增效率高 ( E = 982 %) 。建 立了基因 RAc1 实时定量 PCR 的质粒标准品。 关键词 : 水稻 ; 肌动蛋白; 基因表达 ; 实时定量 RTPCR ; TaqMan 探针 中图分类号 : Q 9432 　　　 　　文献标识码 : A 　　　　　　　文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 01- 075 - 07 Establishment of Realtime TaqManFluorescence Quantitative RTPCR Assay for Detection and Quantif ication of mRNA Expression of RAc 1 of Rice