DNARNA之间的杂交。.pptVIP

 核酸分子杂交技术 第 一 节 核酸分子杂交的基本原理 原理：碱基互补配对原则 一、核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。 杂交可分成：DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之间的杂交。 待测核酸序列 探针(probe)：已知核酸序列 二、DNA的变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开 成两条单链的过程。 方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、 甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 变性后其它理化性质变化： OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 例：变性引起紫外吸收值的改变 热变性 解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。 Tm=（G+C）%×0.41+69.3 三、DNA的复性 DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可 恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(annealing) 。 减色效应 DNA复性时，其溶液OD260降低。 复性的速度受到诸多因素的影响： 1.核酸分子的浓度：一般适宜的探针浓度为 0.1～0.5μg。 2.核酸分子的长度：核酸探针的长度控制在 50～300bp 3.温度：适宜的复性温度是较Tm值低25℃。 4.离子强度：离子强度过低，不利于复性。 5.核酸分子的复杂性。 第 二 节　 核酸分子杂交的基本方法 核酸分子杂交的类别 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 　　　用于基因组DNA的定性定量分析、酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析（RFLP）等。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 　　　用于RNA的定性定量分析。 其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) （一）Southern 印迹杂交 DNA 印迹 E. Southern 1975 年 方法 1. 酶解DNA 限制性内切酶（Restriction Enzyme, RE） 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP） 在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异（称为中性突变），中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶切水解该DNA片段就会产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性。 2. 分离 电泳 在电场中带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 3. 凝胶中核酸的变性 碱变性 中和处理 4. 转膜 硝酸纤维素膜 尼龙膜 转膜方法 毛细管虹吸印迹法 电转印法 真空转移法 毛细管虹吸印迹法 电转印法 真空转移法 5. 杂交 预杂交：封闭非特异性DNA位点。 杂交 6. 杂交结果的检测 Southern 印迹的应用 基因诊断 法医学 DNA的多态性。 微卫星DNA和小卫星DNA等是重要的多态性标志。 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP) DNA指纹（DNA finger-print）分析的基本流程如下： DNA的提纯与纯化→限制性内切酶消化→电泳分离→分子杂交→指纹图的显示 假设一对夫妻，生了一男一女，又领养了一个女孩，妻子还带来与其前夫所生的女儿。这一家人的DNA指纹如图所示。由此可推断出：A和C是亲生儿女；B为妻子和其前夫所生；D为养女  （二）Northern blot 　　和Southern blot不同在于： A：靶核酸是RNA； B：RNA电泳时，凝胶中加入变性剂，防止　　 　　RNA分子形成二级结构； C：电泳结束后直接转膜。 (三）原位杂交(in situ hybridization)