蛤仔实验方案.docVIP

重金属离子对菲律宾蛤仔酶活性的影响 一、问题的提出 重金属离子是否会对菲律宾蛤仔的谷胱甘肽过氧化物酶（CPX）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性产生影响？二、实验假设与理论依据1.实验假设 重金属离子Cu、Zn、Cd、Hg、Pb会对菲律宾蛤仔的谷胱甘肽过氧化物酶（CPX）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性产生影响。导致菲律宾蛤仔的生理条件发生变化，从而致死。活性 2.理论依据 一定浓度的重金属离子会导致菲律宾蛤仔的死亡。三、实验目标 通过对菲律宾蛤仔染毒前后酶活性的测定及比较，证明重金属离子对菲律宾蛤仔酶活性有影响。 四、实验对象及方法1.实验对象 菲律宾蛤仔2.实验方法 将菲律宾蛤仔培养于不同浓度梯度的不同重金属离子中，通过测量其CPX、CAT、SOD的活性，得到其活性变化曲线，从而证明重金属离子对菲律宾蛤仔酶活性有影响。（今后可通过测量某一水域中的菲律宾蛤仔中酶活性变化从而对水域中重金属污染进行检测。）3.检测手段（数据统计） 取培养后的菲律宾蛤仔，从腮和消化盲囊中提取CPX、CAT、SOD，经生化反应，由分光光度计测出在特定波长下的吸光值，并分别做出酶活性的变化曲线，再与染毒前的正常酶活性进行比较。五、实验过程1.准备阶段 买健康的菲律宾蛤仔到实验室饲养3天，确保其成活。 所需试剂及器材：双蒸水、蔗糖、Tris-Hcl、HgCl2、Pb(NO3)2、ZnSO·4H2O、CdCl2·2.5H2O、CuSO4·5 H2O、烧杯、手术剪、手术刀、离心管、离心机、2.实施阶段（起止时间） 染毒前菲律宾蛤仔CPX、CAT、SOD在最适温度和PH下的酶活性的测定 ①将菲律宾蛤仔在正常条件下养殖3天。 母液的成分成分 取用数量（ml） 终浓度（m mol/l） 1mol/l Tris-Hcl(ph8.2) 10 100 1mol/l 蔗糖 25 250 双蒸水 65 合计 100 ②制备组织匀浆液：按下表的比例配制，放入棕色试剂瓶中，高压灭菌锅（121℃,20min）后，至于4℃冰箱中。 ③在4℃预冷的匀浆也中漂洗，滤纸试干后放入小烧杯中。先将少量匀浆液倒入烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织。然后再向小烧杯倒入剩余的匀浆液，配成浓度为10%的组织匀浆液。将制备好的匀浆倒入离心管中，以30000---40000转每分离心10-15分钟，取上清。稀释为1%的组织匀浆作为待测酶液。 ④将待测酶液在最适温度和PH值的条件下测出其酶活性。 谷胱甘肽过氧化物酶可以催化GSH产生GSSG，而谷胱甘肽还原酶可以利用NADPH催化GSSG产生GSH，通过检测NADPH的减少量就可以计算出谷胱甘肽过氧化物酶的活力水平。在上述反应中谷胱甘肽过氧化物酶是整个反应体系的限速步骤，因此NADPH的减少量和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。具体可以购买谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒进行测定。 H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。具体可以购买超氧化物歧化酶检测试剂盒进行测定。 由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。具体可以购买超氧化物歧化酶检测试剂盒进行测定。 2）对菲律宾蛤仔进行重金属养殖 ①汞对蛤仔96h的半致死率的浓度为 0.73 mg/l;镉的96h 的半致死率的浓度为3.66 mg/l;铅对蛤仔96h 的半致死率的浓度为4.21 mg/l;锌对蛤仔96h 的半致死率的浓度为5.43 mg/l;铜对蛤仔96h 的半致死率的浓度为116.84 mg/l;铬对蛤仔96h 的半致死率的浓度为148.73 mg/l。由Cu、Zn、Cd、Hg、Pb五种重金属离子96h时的半致死率浓度分别计算出它们1/2、1/4、1/6、1/8、1/10的浓度作为浓度梯度。 ②将等量的菲律宾蛤仔（25只）放入各种重金属离子的不同浓度梯度的溶液中养殖，一天后每桶中取5只，取其鳃和胃盲囊制成匀浆液进行酶活性的测定，并以浓度为横坐标，以酶活性为纵坐标绘制三种酶活性的曲线。