2012overlap原理总结.docVIP

简单讲，原理如下：引物1（正向）和引物2（反向）扩增产物为A；引物3（正向）和引物4（反向）扩增产物为B，现在欲将产物A和B融合为产物C。在设计引物时，先按照普通引物设计好，然后在引物2的5’端和引物3的5端分别加上4-8个碱基（引物2所加的碱基应为产物B的5 端4-8个碱基序列；引物3所加的碱基应为产物A的3 端4-8个碱基序列）。第一轮PCR，先分别用引物1、引物2扩增出片段A；引物3、引物4扩增出片段B。分别割胶回收产物A和产物B，这样扩增出来的产物A和B会具有相同的末端。第二轮PCR，用引物1和引物4来扩增，用第一轮的两种扩增产物A和B混合稀释之后为模板，进行扩增。因为产物A和B有相同重叠的末端，在PCR反应时，模板变性、退火、延伸，就会将A和B融合成产物C。  ?overlap能成功，要点是overlap的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘”在一块）。所以overlap的部分要有一定长度（一般有25bp的重叠区应该够长），并且注意这部分的GC含量，以便使这部分（重叠的25bp）有一个合适的Tm值（例如65度），而且使用的PCR循环所用的退火温度应该低于此温度——否则overlap的部分可能“粘”不到一起。? ?? ???另外一点是要意识到overlap的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构！尤其是PCR退火温度较低、降温速度较快时更增加这种情况的几率。前后两段越长越容易形成某种空间结构。而这种空间结构可能会对overlap区的退火造成影响。 当然，overlap区本身也有形成某种空间结构的可能（例如发夹结构），但这可以通过软件设计（如引物设计软件）来避免。? ?? ? 如果使用该技术还得不到全长片断，我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。遇到这种情况建议使用TouchDown PCR试试。TouchDown PCR方法在分子克隆上有介绍。这种PCR使用一个较高的退火温度，循环几周（如三周）后降一度，然后在此温度上再循环几周，以此类推。通常最高和最低退火温度间可相差十度。Touch Down PCR有利于解决空间结构影响overlap区退火的问题，增加扩增成功的机会。 PCR相关网站 PCR相关的专业网站一个PCR相关的专业网站，内容很全 / 实验方法与步骤详解 /Protocol/home.htm 美国AXYgen公司 /NewFiles/pcr.html / This 158 page PCR manual covers the following topics PCR Primer design PCR Methods PCR Polymerases PCR Variables PCR Troubleshooting Special PCR Topics Appendixes and a comprehensive Index BioGuide - PCR http://bip.weizmann.ac.il/mb/bioguide/pcr/contents.html 魏茨曼基因组和生物信息学研究所的一个网页，介绍PCR的初步知识。 包括： What is PCR? What are some good reference books for PCR? How should I select a set of primers to use for PCR? Programs for designing PCR primers What is Hot-start PCR? What is AP-PCR or RAPD PCR? What is Touchdown PCR? Is there a simple method to sequence lambda, M13, or plasmid clones using PCR? A Look at PCR Cloning Tools /post/view?b ... sty=1tpg=63age=0 PCR常见问题及回答 /techtitle/main/faq_PCR.htm#2 PCR和Realtime PCR的原理讲的很透, 一个介绍Realtime PCR的教学网站，里面的powerpoint文件非常好 :85/pcr/realtime-home.htm SYBR Green PCR /post/view?b ... ppg=1age=0#638781 PCR QUICK GUIDE http://www.wzw.tum.de/gene-quant ... bio309/default.html PCR拼接 /post/view?b ... sty=1tpg=47age=0 知道蛋白如何寻找其氨基酸序列 /post/view?b ..