细胞培养的污染和排除.docVIP

第十一章 细胞培养的污染和排除 组织培养细胞被有害物污染是组织培养工作的大敌。应用组织培养进行研究工作，除需要好的实验设计和技术方法外，成败的关键还在于能否避免污染。一项好的研究,或建成的满意细胞系，往往由于遭受污染而前功尽弃。因此，一个组织培养工作者,要始终注意防止污染。 培养细胞被污染，人们最注意的是真菌、细菌和病毒等微生物。现在看来已经不够，当前“污染”一词的概念应该是，凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都应视为污染。从这一概念考虑，组织培养污染应包括以下几个方面： 微生物：真菌、细菌、支原体和病毒 化学物质：影响细胞生存的非细胞所需的化学成分 细 胞：非同种的其它细胞 当然在培养中以微生物污染最为多见，化学污染较少；但近年随细胞种类增多,不同种细胞交叉污染却屡有发生，以致在ATCC接受入库细胞中特设同工酶检测一项，目的在于证明是否有HeLa等细胞的交叉污染。但细胞交叉污染只要工作细心，是容易防止的，而微生物污染在实际工作中却是最难防止和易发生的。 第一节 污染途径 各种污染主要通过以下途径和媒介发生： 一.空气 空气是扩散微生物的主要途径。由于空气流动性大，在操作场地与外界隔离不严和消毒不充分的情况下，外界不洁空气很容易侵入造成污染。因此，培养设施不宜置于通风场所。现各实验室普遍应用净化工作台，能产生无菌的屏障气流，可防止不洁空气污染。净化工作台使用过久，过滤层受尘埃堵塞情况下，工作时不带口罩或外界气流过强、污染空气均可进入操作野，导致污染。又不同季节和不同地区空气内含菌数不同；炎热夏季尤其南方多雨地区空气湿度大、含菌数量多，工作应特别注意。空气是不断流动的；虽用消毒措施也难以排出空气中所有微生物，但每立方米内含菌数不应超过1～5个。 二.清洗消毒 培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等，都可引入有害物。 三.操作 实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口时不严，都可发生污染。同时培养两种以上细胞，操作不慎，使用同一吸管或培养用液，可能导致细胞交叉污染。 四.血清 血清也是污染细胞的来源，有的市售血清制备水平低、检测不严，常已被支原体和病毒污染。 五.组织 初代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织(如 已经发生溃烂的肿瘤组织)；手术用碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染。 第二节 污染对细胞的影响 在细胞受有害物污染时间短、污染程度轻、并能及时排除污染物的情况下，细胞有可能恢复。当污染物持续存在于培养环境中时，轻者细胞增殖生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增强，重者细胞停止增殖，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。但根据污染物的不同，对细胞的影响有别。 有的微生物如支原体，无致死毒性，可与细胞长期共存，对细胞形态和功能的影响是潜在的。而病毒、细菌和霉菌的增殖迅速，能在短时间内在数量上压过细胞或产生有毒物杀死细胞。化学物，如重金属或其它非培养必需化学试剂混入培养液中后,有的毒性小，被排除后，细胞仍可生存；有的烃化物如多环芳烃有致突变性，能导致细胞发生转化。 一、真菌污染 在微生物污染中，以真菌污染最多，最常见的有：烟曲霉(Aspergillus Fumigatus)；黑曲霉(Aspergillus Niger)；毛霉菌(Mucor)；孢子霉(Oospora)；白念珠菌(Candida)；酵母菌(Yeast)。 真菌种类繁多，形态各异，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。 二、细菌污染 较常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌，白色葡萄菌等。细菌污染后大多能改变培养液pH使培养液变混浊，也有的对培养液无肉眼可见影响，只在镜下观察发现菌体时才能感知污染。细菌增殖迅速，能消耗营养液和产生毒素抑制细胞生长，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，出现明显污浊现象；细菌和霉菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生。而且由于增生迅速，多在发生污染48h以内就已明显。因此在实验的最初两天密切观察实验样本是否有污染发生，这样可及时采取措施予以补救或排除。 三、支原体污染 支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。从1952～1972年间，有人检查了54个实验室的9700个各类培养细胞时发现，有11%的细胞受到了支原体的污染。