2012生物技术实验方法.docVIP

《生物技术实验》教学大纲 课程编码: 实验学时:18 实验学分:1 一、本实验课的性质、任务与目的 本课程是一门专业基础实验课，综合了生物化学技术、微生物技术、细胞工程、生化工程、微生物工程等方面的实验内容，在注重专业基础性和可操作性的前提下突出先进性和系统性，加强教学内容的选择性。通过本课程的学习和实践，要求学生掌握细胞工程技术、微生物学技术以及相关领域的实验原理和方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术以及相关领域的科学研究工作打下基础。 二、实验基本要求 调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备、设计具体实验方案，适时组织学生外出自取实验材料，让学生和教师共同讨论理论和实验问题。成绩评定要把学生的实际动手能力和创新精神放在重要地位。实行课堂讲授指导辅以多媒体演示。指导学生分析总结实验结果，学会正确书写科学论文。 本课程可根据实验设备等具体情况，安排下列实验中的6-8个实验，每个实验3学时。 三、实验项目与要求： 序号 实验项目名称 时数 项目要求 项目类型 项目性质 目的要求 1 甜酒酿的制作 3 选修 操作 设计 学习掌握微生物菌种保藏的原理和基本方法。 2 DNA提取 3 必修 操作 验证 掌握DNA提取的方法，以及DNA的基本量的概念。 3 PCR基本原理和方法 3 选修 操作 验证 了解PCR扩增的基本理论及过程。 4 电泳技术 3 必修 操作 验证 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 5 微生物的单细胞分离 3 选修 操作 验证 学习微生物单细胞分离的原理，掌握微生物单细胞分离的方法。 6 植物组织培养基的配置 3 选修 操作 设计 学会使用灭菌设备,以及培养基配置的基本过程。 注：1、项目要求：必修、选修、其他；2、项目类型：演示、操作、模拟；3、项目性质：验证、综合、设计、研究。 四、成绩考核方式及评分标准 平时实验报告50％，期未实验操作考试25％，期未实验理论考试25%。 五、主要实验教材（指导书）及参考用书 生物技术实验与仪器操作指南李多伟等编 西北大学出版社，1996年 试验一、PCR基本原理和方法 试验目的: 了解PCR技术的基本原理，设备，药品，过程。 试验内容： RAPD是随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphic DNA）的英文缩写,是Williams等人(1990)发展起来的一种新型遗传标记，尽管这一技术比较年轻，但由于其独特的检测DNA多态性的方式即极快速、简捷、高效等优点，使得RAPD技术已渗透于有关基因研究的各个领域。RAPD是建立于PCR基础之上的，利用随机的脱氧核节酸序列作引物(一般9~10碱基对)，对所研究的基因组DNA体外扩增，扩增产物经电泳分离染色后，来检测其多态性，这些扩增DNA片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD标记特点是：（1）RAPD扩增引物没有物种的限制，一套引物可用于不同物种基因组分析;（2）RAPD扩增引物没有数量上限制，可以囊括基因组中所有位点;（3）RAPD技术简捷方便，可进行大量样品的筛选。RAPD是指随机扩增的多态性DNA，它以一个10碱基的任意序列的寡核苷酸片段为引物在未知序列的基因组DNA上进行随机的PCR扩增。RAPD反应并不要求特别纯的DNA摸板，重要的是在每一个反应中DNA的终浓度，一般认为在每个反应中，5-500ng范围的摸板能提供最好的结果。最佳的模板浓度范围取决于研究的类群与模板的纯度，在DNA模板不很纯的时候下，宁可用使用有效浓度范围内的最低限度，使抑制聚合酶活性的因子的影响因素降到最小。 1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。 2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。 3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。 以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。 总反应体系为25 μl，随机引物使用S80(ACTTCGCCAC)和S90（AGGGCCGTCT）两种。PCR扩增程序为94℃预变性3min；94℃变性50 s；38℃退火1 min；72延伸2 min；40个循环；72延伸5 min后4℃保存。在25 μl PCR反应终产物中，吸取10 μl反应液与2 μl 6×加样缓冲液混合，在1.8%琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为