大肠杆菌中胞外分泌N糖蛋白的生产.docVIP

大肠杆菌胞外分泌蛋白 Adam C. Fisher,1Charles H. Haitjema,2? Cassandra Guarino,3,4? Eda C? elik,3? Christine E. Endicott,3? Craig A. Reading,1Judith H. Merritt,1A. Celeste Ptak,5Sheng Zhang,5and Matthew P. DeLisa2,3,4* 摘要 空肠弯曲菌Campylobacter jejuni）的pgl基因组编码的一个完整的N蛋白糖基化的途径，移到大肠上去。在这个系统中，我们分析N糖基化，细菌中膜和受体蛋白折叠之间的相互作用。我们开发了一个重组N –受体肽，允许不同的重组蛋白的糖基化，蛋白质在糖基化大肠杆菌的质中表达。用这种糖基化，一个明显不同在观察到了，蛋白决定了内膜的模型（i.e., Sec，信号识别颗粒[SRP]，或双精氨酸[TAT]导出），这种现象表明可以影响N -糖基化效率。我们也建立工程蛋白周质外的环境，比如外膜，，和细胞外，这些可以作为N糖基化。两者合计，我们的结果表明，空肠弯曲菌N -糖基化的组织大肠杆菌中的不同的分泌机制，有效扩大重组大肠杆菌N –。此外，这个简单的糖基化扩大了糖工程和打开了细菌合成重组的大门。 天冬酰胺（N）蛋白糖基化是至关重要的且保留在真核生物有机体中。它是最普遍的所有蛋白质翻译后修饰，影响到近70%的真核蛋白质组。可影响折叠和稳定，齐聚，抗水解，排序，和运输。N -连接的糖基化发生在内质网（ER）且涉及到内质网膜脂质载体上多糖的装配,其次是转移到特定的天冬酰胺残留的目标多肽。 最初， N –糖基化真核生物。然而， N -糖蛋白被描述，包括古菌和最近的细菌，Campylobacter jejuni）。在空肠弯曲菌，包括一个17-kb命名为的蛋白糖基化基因。迄今，超过40种周质膜糖蛋白已被确定为空肠弯曲菌，且大多数这些绑定到N -乙酰半乳糖（GalNAc）-大豆凝集素（SBA）。质谱和核磁共振共振（NMR）的研究显示，N聚糖就是GlcGalNAc5Bac，这里Bac是细菌糖胺（2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧葡萄糖）。这分支七糖通过添加在脂质载体上的激活核苷酸糖以及细胞质的十一碳烯焦磷酸来合成。一旦，脂连的七糖通过假定的ATP结合PglK快速翻转通过膜。七糖通过一种叫PglB的寡糖传输催化转移到了周质培养基蛋白上。PglB单个完整的蛋白和催化真核亚基OST STT3有相似性。PglB七糖在天冬酰胺酸上，以D/E-X1-N-X2-S/T为基本图案（在这里X1，X2是脯氨酸任意残），一种相似于真核细胞糖基化位点。 近期Wacker和合作者把整段空肠弯曲菌C.jejuni）pgl基因转移到大肠杆菌上，赋予这些分子的能力。天然空肠弯曲菌C. jejuni）糖蛋白例如Peb3和AcrA能通过Sec途径。AcrA。除了质蛋白，一些天然空肠弯曲菌C.jejuni）N-糖蛋白。共同的，这些早期的研究表明空肠弯曲菌C.jejuni）N-连接糖蛋白组织不同的分泌机理从不折叠多肽到完整折叠蛋白域（虽然高度复杂且溶剂暴露）。受到膜迁移和细菌上受体蛋白的影响，糖基化还没有被完全完成。，例如外膜或细胞外培养基是否N糖基化还不知道。 本文的目的在于研究不同分泌和细胞外蛋白培养基在大肠杆菌中糖基化的程度。为了解决这个问题，我们开发了一种基因多肽，它能附加在末端或植入重组蛋白位置。许多用GT来修饰的重组蛋白在大肠杆菌中可靠地被糖基化 当GT被用来和通过不同输出途径（e.g., Sec,信号识别颗粒[SRP]，或Tat）定位到周质上的蛋白质结合时，我们发现这些蛋白质在糖基化模型中的一个明显不同之处，这取决于他们在内膜上迁移的模式。在所有测试的事例中，通过GT的没有对蛋白质活性产生任何可测量的影响。最后我们发现定位不同位点的蛋白质是很容易N糖基化的，这些位点包括周质，外膜，和细胞外。 材料和方法 细菌菌种和生长条件 所有这个研究用到的菌种都在表1中列举了。大肠杆菌DH5α用作质粒的克隆，大肠杆菌菌株CLM24 (16)用在所有糖蛋白表达实验中除非特别标记。由于分子表面糖蛋白的标记，大肠杆菌菌株BW25113 ?waaL::Kan被使用（3）。为了外膜，大肠杆菌菌株CE8032P1vir噬菌体的转导来生产。简单来讲，卡那霉素标记的等位基因能在受体分子JC8031中转导，其中JC8031是一种有很多小泡的tolRA的突变菌株，等位基因能从BW25113 ?waaL::Kan 中得到。由于YebF影响分泌研究，MC4100菌株由于有最小的麦芽糖结合蛋白（MBP）漏损率而被使用，其中有15个普通的大肠杆菌菌株被测试，其中一个衍生菌株在它早期成长阶段没有M