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课题背景及意义 1.1课题背景 细胞质膜的物质交换对正常的细胞功能是至关重要的。释放物质至细胞膜表面或细胞外空间的过程称为胞吐。生化和遗传研究已经确定了一些在胞吐过程中发挥重要作用的蛋白复合物。虽然我们对胞吐的生化及生理等方面有了比较深入的了解，但是对于胞吐的物理特性，如蛋白分子如何调控囊泡的运动，囊泡与细胞膜的锚定及融合等过程还是知之甚少[1]。为了解决这个问题，全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）经常被用来观察囊泡运输中生理和生化等步骤的时空关系。 全内反射荧光显微镜利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。 1.2 意义 随着当今显微镜技术的迅速发展，研究人员的工具日益强大，所观察到的细胞结构更为细微，但同时得到的数据信息也是大大的增加。囊泡融合点可以在小于几秒时间内发生，图像采集的帧速率必须足够高。细胞成像速率一般为每秒5-20帧，这意味着即使对实验的观察只持续几分钟也要处理大量的数据。典型的TIRF序列图像包括几千帧，从中可以看到数以百计的囊泡[2]。因此，如果采用人工检测囊泡的行为工作量将会变得非常大，而且不容易实现。因此这就决定了自动检测囊泡融合点这项技术的重要性。 葡萄糖(Glucose)是维持细胞代谢和生命活动的重要原料，小肠吸收或肝脏产生的葡萄糖通过血液流向体内的各个器官和组织。葡萄糖是一种极性分子，不能以自由扩散的方式通过细胞膜脂质双层结构的疏水区，除小肠和。肾小管可以通过主动运输方式吸收葡萄糖外，其他组织的细胞都必须通过细胞膜上的一类葡萄糖转运蛋白(Glucose transport—er8)通过易化扩散来摄取葡萄糖。其中葡萄糖转运蛋白4(Glut4)是骨骼肌等细胞摄取葡萄糖的重要媒介，是维持机体糖稳态的关键环节。因此，对Glut4的囊泡运输及相关蛋白、分子信号转导通路以及相关临床疾病的研究意义重大，成为国内外研究的热点。[3] GLUT4的主要功能是在肌肉和脂肪组织中转运葡萄糖。在没有刺激时，90％以上的GLUT4分布于细胞内，如微粒体、高尔基复合体、管型囊等囊泡样结构中，这些囊泡样结构称作GLUT4储存囊泡(GSVs)(GLUT4 Storage Vesicle，GSV)。在胰岛素刺激或运动刺激下，脂肪细胞和骨骼肌细胞中的GLUT4会从细胞内转位至细胞膜上。在刺激消失后，细胞则通过内吞功能把GLUT4从细胞外膜运回细胞内，贮存于囊泡中。[4] 因此囊泡融合点的检测，对于胰岛素在人体内的分泌，运输的研究有着重大作用。 2.国内外研究现状 2.1国内研究 2007年1月， Cell Metabolism发表了徐涛研究组的题为“Dissecting Multiple Steps of GLUT4 (Glucose Transporter GLUT4) Trafficking and Identifying the Sites of Insulin Action”的研究论文。研究人员利用全内反射荧光显微成像方法研究了胰岛素对GLUT4贮存囊泡的调控作用，为深入研究胰岛素信号通路打下了科学基础。 但该方法并不完全自动化，该系统为半自动系统识别囊泡融合点。他们在MATLAB中开发了一个程序用于半自动分析GSV运动，通过观察囊泡的移动，在选择了五个连续帧后小于一个像素的囊泡基础上，对这些囊泡再进行人工的识别，从而识别出真正的囊泡融合点。这项工作排除了大量非囊泡融合点，大大减少了人工识别囊泡融合点的工作。[5-6] 此外，国内还有一篇由何煦、顾新华、赵国玺、戴光松、吴世康发表的荧光探针法研究囊泡融合的动力学，但是此文献是应用荧光搽针法研究双(月桂酸)三乙醇胺醇形成囊泡的融合动力学过程，重点不在于囊泡融合点的自动检测。现在有关于囊泡融合点的自动检测在国内的研究仍然较少，很多实验是由国外实验室所完成的。[7] 2.2 国外研究现状 在2009年Mele等人发表的Towards fully automated Identification of Vesicle-Membrane Fusion Events in TIRF Microscopy 一文中，提出了一个完全自动化的系统融合点的检测方法,是一种基于刚性模板和目标跟踪的技术。 他们是通过囊泡轨迹来检测囊泡融合点的。他们通过建立囊泡的运动轨迹，对比囊泡融合时的特点，来判断是否为真正的囊泡融合点。[8] Tran等人还开发了定量技术,揭示了在细