层析分离的基本原理与特点.ppt

第七章 层析分离技术 第一节 层析的基本原理与分类 一、层析分离的基本原理与特点 （一）基本原理 层析分离是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。 （二）层析分离具有如下基本特点 优点：（l）分离效率高。 （2）应用范围广。 （3）选择性强。 （4）设备简单，操作方便。 缺点：处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此主要用于实验室，工业生产上还应用较少。 （三）层析的基本概念 1.固定相 2.流动相 3.分配系数及迁移率（或比移值） 4.分辨率（或分离度） 5.正相色谱与反相色谱 6.操作容量（或交换容量） 二、层析分离技术的分类 （三）依分离机理分 1.吸附层析 2.分配层析 3.凝胶过滤 4.离子交换层析 5.亲和层析 6.疏水层析 第二节 层析分离的基本操作技术 （二）柱层析系统的基本操作技术1.装柱2.平衡3.加样4.洗脱5.流速控制6.分部收集7.洗脱峰检测、合并收集8.层析介质的再生 二、纸层析基本操作技术 （一）滤纸 （二）展开剂 （三）操作方法 （四）在抗生素中的应用 三、薄层层析基本操作技术 （一）基本原理 （二）吸附剂和展开剂的选择 （三）基本操作 1.薄层板的制备 2.样品的预处理 3.点样、展层与显色 4.影响Rf的主要因素 5.薄层色谱法的应用 第三节 吸附柱层 一、吸附层析的原理与特点 基本原理同吸附薄层色谱法。 二、吸附剂的选择 常用的吸附剂除氧化铝、硅胶和聚酞胺外，还有活性炭。 吸附剂的种类很多，而对吸附剂的选择尚无固定的法则，一般需通过小样实验来确定。 三、吸附柱层析的基本操作与应用 三、吸附柱层析的基本操作与应用 三、吸附柱层析的基本操作与应用 第四节 离子交换柱层析 一、原理与特点 （一）离子交换剂的基质（二）离子交换剂的电荷基团根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。（三）交换容量交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。 （四）离子交换剂的选择、处理和保存 1、离子交换剂的选择取决于被分离的物质在其稳定的pH值下所带的电荷，离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换剂颗粒大小有关。 2、离子交换剂的处理和保存处理：干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，再用酸碱分别浸泡 3、离子交换树脂的选择依据 三、离子交换柱层析的操作与应用 （一）离子交换柱层析的操作 1．层析柱 2．平衡缓冲液 3．上样 4．洗脱缓冲液 5．洗脱速度 6．样品的浓缩、脱盐 （二）离子交换柱层析的应用 1.水处理 2.分离纯化小分子物质 3.分离纯化生物大分子物质 第五节 凝胶柱层析 一、凝胶层析的原理 二、凝胶的种类 1.葡聚糖凝胶 2.琼脂糖凝胶 3.聚丙烯酰胺凝胶 三、凝胶柱层析的操作与应用 （一）凝胶柱层析的操作特点 1、凝胶柱层析优点：（1）分离条件温和，因此不易引起生物样品的变性失活；（2）每次分离操作之后，层析剂无需再生就可重复利用；（3）工作范围广，分离的分子质量范围可从几百到数百万；（4）设备简单，分离机理简单，易于操作；（5）样品回收率高，几乎可达100%。 2、凝胶层析的缺点：凝胶层析上样量小，操作压力不能高，流速较慢。 （1）主要用于脱盐（2）类分离（3）分级分离（4）生物大分子分子量的测定 （二）凝胶柱层析的特点与应用 第六节 疏水柱层析 一、疏水层析的原理 亲水性蛋白质（酶）表面均含有一定量的疏水性基团。尽管在水溶液中蛋白质（酶）具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的趋势，但总会有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质（酶）表面。这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基会发生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附剂）所吸附。 二、疏水性吸附剂 三、疏水柱层析的操作与应用 （一）疏水柱层析的操作特点 1、层析柱的制备 2、平衡 3、加样与洗脱 4、再生 （二）疏水柱层析的特点与应用 1、疏水柱层析特点：（1）疏水柱层析可直接分离盐析后或高盐洗脱下来的蛋白质、酶等生物大分子溶液；（2）分辨率很高、流速快、加样量大；（3