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实验三、土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌计数、分离与纯化 一、目的要求 分离、纯化 通常采用平板涂布、倾注或划线法可以获得单菌落。 挑取由单个细胞繁殖而来的菌落（单菌落）进行培养就可以获得由一个细胞繁殖而来的纯系。 培养条件和方法 三、实验材料 四、实验内容 计数理想状态 计数公式 菌落计数方法 （1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。 菌落计数方法 （2）首先选择平均菌落数在30—300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。 （3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30—300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数。若大于2，则取其中较小的菌落总数。 菌落计数方法 （4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。 （5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。 （6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。 （一）细菌、酵母菌的稀释分离计数 1、稀释样品 称取土样1g，在火焰旁加入到有99ml的无菌水三角瓶中，振荡10-20分钟，制成10-2的稀释液 再用微量移液管在10-2的稀释液吹吸3次，然后从10-2的稀释液里取0.5ml加入到标有10-3的4.5ml无菌水中，在左手上敲打、上下翻转20-30次，制成10-3倍液。依次制成10-4 10-5，10-6，10-7倍液。 2、涂布法分离细菌并计数 取取牛肉膏蛋白胨培养基融化并倒平板，待冷却后每皿分别加入0.1ml或0.2ml的10-5，10-6，10-7 的稀释液，用无菌玻璃涂棒自平板中央均匀向四周涂布，每个浓度作2个重复。冷凝后30℃倒置培养24-48h，计数 ，每组挑取某个菌落斜面（3支）划线培养。 涂布法 涂布法 3、涂布法分离酵母菌并计数 取YPD培养基融化并倒平板，待冷却后每皿分别加入0.1ml 或0.2ml的10-4，10-5 ，10-6的稀释液，用无菌玻璃涂棒自平板中央均匀向四周涂布，每个浓度作2个重复。冷凝后30℃倒置培养24-48h，计数。每组挑取某个大而厚的菌落（1支）划线培养 （二）放线菌的分离计数 10%的酚溶液的作用 倾注法 插片培养 （三）霉菌的分离计数 * 1、学习掌握细菌、放线菌、酵母菌及霉菌稀释分离技术。 2、学习从样品中分离、纯化出所需菌株。3、学习并掌握平板倾注法、涂布法，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养时间和培养条件。 4、学习平板菌落计数法。 二、基本原理 2-3 28-30 YPD培养基 10-4，10-5 ，10-6 稀释分离 酵母菌 土样 3-5 28-30 马丁氏 10-2，10-3，10-4 稀释分离 霉菌 土样 5-7 28 高氏1号 10-3，10-4，10-5 稀释分离 放线菌 土样 1-2 30-37 牛肉膏蛋白胨 10-5，10-6，10-7 稀释分离 细菌 土样 培养时间（天） 培养温度（℃） 培养基 稀释度 分离方法 分离对象 样品来源 1、土样 小白菜土样，铲去表土层2-3cm深土壤10g 2、培养基（平板及斜面） 牛肉膏蛋白胨、高氏1号、马丁（链霉素、孟加拉红、去氧胆酸钠）、 YPD培养基 3、 无菌水 250ml三角瓶装99ml无菌水2瓶，250ml三角瓶装95ml无菌水（霉菌）， 每瓶装10粒玻璃珠。每组5支试管，装4.5ml无菌水 4、 其它物品 无菌培养皿、无菌移液管（6支/组）、无菌玻璃涂棒、称量纸、试 管架、药勺、10%酚溶液 、接种环、 0.1ml或0.2ml（涂布）或1ml（倾注） 1g土样 99ml无菌水 10-3 稀释样品 分离接种 10-4 10-5 10-6 10-7 10-2 土壤中分离某种微生物的过程 4.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 均匀，30-300 高浓度是低浓度的10倍 相同浓度三培养皿相近 每克样品中微生物的活细胞数CFU/g = （细菌、放线菌、酵母菌及霉菌） 某一稀释度的平板上菌落平均数×稀释倍数 每个平板上加入的ml数×含菌样品克数 30500或3.1×104 305