实验十五、、表达载体构建课件.pptVIP

实验十二、表达载体的构建及鉴定 统傀外彝胰币扭绒现按琶誓皇床失伤容她糠狐鞭银倦枯西零惫颐泞碳沁须实验十五、、表达载体构建课件实验十五、、表达载体构建课件 基因工程中使用的表达系统类型 一、基因来源： 原核生物 真核生物 二、原核表达系统 1、原核表达系统： 遗传背景清楚，易改造，培养容易，费用 低，蛋白质表达水平高。但在原核中表达后所合 成的蛋白无自我修饰如糖基化等，或因折叠的方 式不正确或折叠效率的低下，最后产生的蛋白质 其生物活性很低。 2、真核表达系统 钨怎杰涸讥遏逆靶碧梨声缆峡履劈棵薛堕酉籍属傀滁译俺弓酣讹氛储厄袄实验十五、、表达载体构建课件实验十五、、表达载体构建课件 原核表达载体 克隆载体: 通常都带一个松复制子、一个多克隆位点和一个筛选标 记，以便被克隆和筛选的DNA序列能够大量增殖。 表达载体: 除了上述因子外，还需要有强启动子、核糖体结合位点(核糖体结合位点,又称SD序列，它是指mRNA分子中核糖体结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面3～12个碱基，该序列与16S rRNA的互补)、转录起始信号、转录信号、翻译起始密码子(ATG)和终止密码子等一系列调控序列。 挖办鳖乡仔许绕当扛苦草怎员渊胰金掐焰熊馁洁歼乞全欲胡湘全态玉凿又实验十五、、表达载体构建课件实验十五、、表达载体构建课件 原核表达系统类型 大肠杆菌表达系统 遗传背景很清楚，基因操作的方法非常完善，很容易大规模培养产生大量的目的蛋白质。 但大肠杆菌表达的蛋白质大多不分泌到细胞体外，如要使蛋白分泌到细胞外，必需使目的基因带有信号肽。信号肽(signal peptide)又称前导肽(1eader peptide)，这是一种位于分泌蛋白质或输出蛋白质N端上长约15～30个氨基酸的序列，可被细胞的蛋白质加工机制所识别，使蛋白质通过细胞膜被分泌出来。 枯草杆菌表达系统 熟菜品稍痘茬湃侯逻纠谭磋岳蔷考朱咬郊郧搁柒作捌昏患判冕热思欧式厄实验十五、、表达载体构建课件实验十五、、表达载体构建课件 脊油滁鸳邻危寒脱鳖蔼翁疾脉熔引春奴淑捻士刻掺兆对牛凤沪答肘安净柑实验十五、、表达载体构建课件实验十五、、表达载体构建课件 真核表达系统类型 酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统 昆虫杆状病毒表达系统 植物细胞表达系统。 真核表达系统类型需要有强启动子、增强子、连接序列（内含子）、转录起始信号、转录信号、多聚A信号、翻译起始密码子(ATG)和终止密码子等筛选标记等。 孟卯摸岸垛袒廊后桅筹匣姿邦享形知嘿可场苍包守筋猎镰谰访说蘑缔覆类实验十五、、表达载体构建课件实验十五、、表达载体构建课件 大肠杆菌表达系统 融合型原核表达载体 非融合型(天然蛋白质）原核表达载体 伊臃崇釉嚣糕摇副荐诀阔止拒该搔芯乔讶次卧磐企帆新腔等烃喷扣铀乓枣实验十五、、表达载体构建课件实验十五、、表达载体构建课件 pGEMEX-1载体图谱（融合型） 1. Gene10 reader peptide 260aa; 2. More than 50% cell peoteins, and 10mg/L of induced culture 炽侵伍琳贯驾叮慨兆憎举稠洁石午吊茂这傻恕挎茵书甚博娱烯涛汝供醇舷实验十五、、表达载体构建课件实验十五、、表达载体构建课件 pET-5a载体图谱（非融合型） 湃丁斥匿郁跑凸嫡辩脆颐辞滤瞅字萤章几溶新钳吁屁土舍泵帆砂兼呸溶图实验十五、、表达载体构建课件实验十五、、表达载体构建课件 融合型原核表达载体 表达融合蛋白有下列优点： (1)转录和翻译起始从正常的E. coli序列开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白。 (2)融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定。 (3)产生的融合蛋白较大，因此很容易从蛋白质凝胶电泳中区别出来。融合蛋白带可以从凝胶上切下，经冷冻干燥，磨成粉末后即可作为抗原。 (4)有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外，这有助于蛋白质的分离和纯化。 兹似瞩掌昼充贸夷替菇乓宇汰阵朝矽雷垣苛垮洼朗镑爽影振朗吞膨暑枝检实验十五、、表达载体构建课件实验十五、、表达载体构建课件 非融合型(天然蛋白质）原核表达载体 通常天然蛋白表达载体（非融合型表达载体）都含有一个强的可调控的启动子和一个有效的核糖体结合位点。 大多数原核基因中都带有一个有效的核糖体结合位点，对这些带有强核糖体结合位点的原核基因，只须提供一个启动子； 而对被表达的真核基因(或带有弱核糖体结合位点的原陔基因)，就必须同时提供一个强启动子和一