蛋白质定向进化技术的发展和应用课件.pptxVIP

蛋白质定向进化技术的发展和应用 ——构建新蛋白质(酶)的一种途径 一、选题背景 • 随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者已经越来越发现，酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求,而且天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低,还缺乏有商业价值的催化功能 • 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程 高效稳定 专一性强 反应温和 适应面广 酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。（Gieseker C M, Celada J D，Rach J 等） 一、选题背景 主要问题 ①建立突变基因文库的方法还需不断优化，对突变控制的能力要进一步提高。 ②筛选目的突变酶方面还需建立一些高通量的筛选方法。 ③关于定向酶的研究较少，临床应用安全性不确定。 一、选题背景 （二）定向进化的原理 定点突变： 1、定点突变 定点突变（site-specific mutagenesis或site-directed mutagenesis）是指在目的DNA片断（例如：一个基因）的指定位点上引入特定的碱基对变化的技术。 最早的通用性定点突变技术是由M. Smith的研究小组于1982年发明的，这种基于M13噬菌体载体的定点突变技术可以在任意一段DNA片断的特点位点上引入点突变。这一技术在其发明后的一段时间曾被世界各国的研究者广泛使用。Smith后来还因为此项研究与PCR的发明者Mullis共享了1993年的诺贝尔化学奖。 定点突变的应用实例—— T4溶菌酶及其几个突变种的特性 （四）定向进化技术的发展 定点突变（site-specific mutagenesis或site-directed mutagenesis） 易错PCR技术(error prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引导重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一种简化的DNA shuffling 技术 过渡模板随机嵌合生长(RACHITT)：与DNA shuffling 概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术. （一） （二） 五、主要结论 五、主要结论 1.目前对酶分子的稳定性改造主要集中在耐热性和耐有机溶剂等方面。 2.化学法修饰可以在一定程度上提高酶的稳定性，但经常伴随着酶活性的损失，并对每批的酶分子都要进行修饰，不同批次之间存在着差异性的问题，解决上述问题是化学修饰今后的研究重点。 3.分子改造中，由于定向进化的工作量较大以及筛选困难，半理性以及理性设计是未来的发展方向，因此如何结合酶分子晶体结构以及计算机辅助模拟来理性设计突变策略在不影响酶活的条件下有效提高酶稳定性是今后研究的重点。 4.糖基化是调节酶稳定性的一种有效手段，但是目前对糖基化影响酶构象机理的研究还不彻底，如何能够理性地设计位点引入糖基化是今后的研究重点。