DNA合成常见问题解答.docVIP

DNA合成 常见问题解答 Q1. ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????? 通常，寡核苷酸应该-20℃保存，该温度下能稳定保存一年以上。寡核苷酸在溶液中较为稳定，但易被污染的核酸酶降解，因此我们建议应干燥储存。若要以溶液形式储存，最好将其分装在几管中分别保存，反复冻融会使寡核苷酸降解。另外，酸性条件下，DNA会因为脱嘌呤作用而降解；碱性条件会使磷酸二酯键水解断裂。 ? Q2. 如何重悬寡核苷酸？???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????? 为便于长期保存，我们建议使用TE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTApH8.0)，而不用无菌水来溶解寡核苷酸。重悬后，寡核苷酸应该在-20癈保存以长期使用。寡核苷酸在无菌水中很难溶解，加一定量的NaOH有助于寡核苷酸在水中溶解。 ? Q3. 如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期，还可以使用吗？???????????????????????????????????????????? ????? 脱水的寡核苷酸是长期稳定的。即使在溶液状态寡核苷酸也相当稳定，通常情况(没有引入使寡核苷酸降解的污染物)即使在室温中放置超过一星期也能使用。 ? Q4. 荧光染料标记的寡核苷酸，在储存和使用过程中必须特殊处理吗？??????????????????????????????? ????? 如果暴露在光线下，荧光染料标记的寡核苷酸比未标记的寡核苷酸更易降解，荧光强度会逐渐降低。为了保持其荧光效能，荧光染料标记的核苷酸应避光-20℃保存。由于Cy3和Cy5在pH大于9时易被降解，所以Cy3和Cy5修饰 Q5. 如何定量合成的寡核苷酸????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????? 合成的寡核苷酸的量非常少，不能直接称重来定量。通常通过测量紫外吸光度值(OD值)来定量。 ? Q6. 如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸？??????????????????????????????????????????????????????????????????? ????? 寡核苷酸的量经常用OD值来描述。1个OD值是体积1ml寡核苷酸溶液，在内径1cm的比色杯中的吸光度值，约为33 mg寡核苷酸，序列不同的寡核苷酸OD值有所不同。因为在260nm处单个碱基的吸光度值是已知的，所以序列已知的寡核苷酸的浓度就可以测定。 dT: 8.8 ml/μmol dG: 11.7 ml/μmol dC: 7.3 ml/μmol dA: 15.4 ml/μmol ????? 对于一段寡核苷酸，它的吸光度等于每个碱基的数目乘以它的吸光系数，然后将4种碱基的结果加起来就是整个寡核苷酸的吸光度。它的浓度可通过下式来计算 ： O.D. =εC (内径1 cm的比色杯) ? Q7. 如一个18个碱基的寡核苷酸包括3个dG,4个dC,5个dA和6个dTOD值是0.7，那么它的量是多少？??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ? 首先，用下面公式计算18个碱基的寡核苷酸的吸光度是多少 ： ε = 11.7 × 3 + 7.3 × 4 + 15.4 × 5 + 8.8 × 6 = 194.1 (ml/ mmole) 然后，通过下式来计算寡核苷酸的浓度： O.D. =εC，C = O.D./εC C = 0.7 /194.1 = 0.0036 (μmol/ml) = 3.6 (nmol/ml) 最后，OD值为0.7的18个碱基寡核苷酸的浓度是3.6nmol。 ? Q8. 如何计算寡核苷酸的分子量?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 寡核苷酸的分子量可以通过下式进行计算： M.W. =(NA ×249.2) + (NC × 225.2) + (NG × 265.2) + (NT × 240.2) + (寡核苷酸长度-1) × 63.98 + 2.02