含GDNF基因的慢病毒载体的构建和其在人胚胎神经干细胞.PDFVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, December 25; 24(12): 2061-2067 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ © 2008 Institute of Microbiology, CAS CSM, All rights reserved 研究报告 含GDNF 基因的慢病毒载体的构建和其在人胚胎神经干 细胞中的表达 1 1 2 1 1 1 1 王淑艳 , 任萍 , 谢淑 , 朱宛宛 , 王暘 , 关云谦 , 张愚 1 首都医科大学 宣武医院细胞治疗中心, 北京 100053 2 国家人类基因组北方研究中心, 北京 100176 摘 要: 利用含胶质源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor, GDNF)基因的慢病毒载体转染了人胚胎 来源的神经干细胞, 探讨了转染后 GDNF 在神经干细胞中的体外表达水平及其影响因素。首先 GDNF 基因被克隆入 慢病毒载体, 通过瞬时转染法包装出病毒上清, 经滴度鉴定后分别按拷贝数为 1 、2.5 、5 、10 转染神经干细胞。转染 后细胞经过潮霉素筛选得到均一表达GDNF 的神经干细胞体系。其后分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-time PCR 方法测定不同转染组细胞在不同时间点GDNF 的蛋白分泌水平和基因表达水平。实验中构建了表达GDNF 基因 的慢病毒载体, 包装出的病毒上清在体外培养条件下成功转染了神经干细胞, 经潮霉素筛选可以得到均一的持续表 达分泌GDNF 的人胚胎皮层神经干细胞体系。实验结果表明转染拷贝数可以影响GDNF 的分泌水平, 相同条件下转 染拷贝数越高, GDNF 分泌量越多, 其基因表达水平越高。因此, 含 GDNF 的慢病毒载体可以成功转染人胚胎来源的 神经干细胞, 使其持续表达GDNF, 转染过程中可以通过拷贝数在一定水平上控制GDNF 的蛋白分泌水平和基因表达 水平。 关键词: 胶质源性神经营养因子, 神经干细胞, 慢病毒载体, 转染 Construction of Lentiviral Vectors Encoding GDNF and GDNF Expression in Human Neural Stem Cells 1 1 2 1 1 1 1 Shuyan Wang , Ping Ren , Shu Xie , Wanwan Zhu , Yang Wang , Yunqian Guan , and Yu Zhang 1 Cell Therapy Center, Xuanwu Hospital , Capital Medical University, Beijing 100053, China 2 Chinese National Human Genome Center, Beijing 100176, China Abstract: We transfected human neural stem