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生物化学实验教案xin11课件
生物化学实验;实验 Folin-Wu法定量测定血糖的含量;二、实验原理;二、实验仪器; 1、标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml)
(1)1%葡萄糖母液:称取1.000g葡萄糖,溶于蒸馏水,稀释并定容至100ml。
(2)葡萄糖标准液:取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中,加蒸馏水定容。
2、10%钨酸钠溶液:称取钨酸钠10g,溶于蒸馏水并定容至100毫升。
3、0.33mol/LH2SO4溶液:于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。
4、碱性硫酸铜溶液
A液:无水碳酸钠35g,酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水,稀释定容至1000ml.
B液:硫酸铜晶体5g,溶于蒸馏水并定容至100ml。
临用时,A液:B液=15:1混合(体积比),混合液于冰箱中保存(4℃)。 ;5、酸性钼酸盐溶液:
称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,倾入另一较大的试剂瓶中,加溴水0.5ml,摇匀,静止数小时后取上清夜500ml,于1000ml容量瓶中,徐徐加入225ml85%磷酸,边加边摇匀,再加25%硫酸150ml。
置暗处次日,用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml,摇匀,用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。
;1、无蛋白血滤液的制备:
用奥氏吸管吸取全血(已加抗凝剂—草酸钠)1ml,缓缓放入50ml锥形瓶中,加蒸馏水7ml,摇匀,溶血后(血液变为红色透明)加10%钨酸钠1ml,摇匀。再加0.33mol/LH2SO41ml,边加边摇,加毕充分摇匀,防止5—15分钟,至沉淀变为暗棕色(如不变色可再加0.33mol/L H2SO41—2滴)。
用干滤纸过滤。先倾入少许,待滤纸湿润后在全部倒入,如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。;2、血糖的定量测定:
取25ml的血糖管(见图1)3支,编号。第一支血糖管中加入1ml蒸馏水(空白管);第二支血糖管中加1ml标准葡萄糖液;用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液1ml,放入第三支血糖管中。
然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液,同时置于沸水浴中8分钟,取出,在流水中迅速冷却后各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后,用蒸馏水稀释至25ml,混匀,用7220分光光度计在420波长处比色,以空白管调节零点。
; 按下式计算100ml全血中所含血糖的含量
m=OD1/OD2× C× 10× 100
式中:
m=100ml全血中含血糖毫克数
C=标准液葡萄糖含量(0.1mg/ml)
OD1=样品液光密度值
OD2=标准液光密度值
;实验 肝糖元的提取和鉴定;二、实验仪器
1、? 新鲜肝脏
2、? 100ml容量瓶
3、? 7220分光光度计
4、? 水浴锅
5、? 试管(ml、2ml、5ml);三、实验试剂;四、实验步骤
1、准确称取肝组织0.5g,放入盛有1.5ml30%NaOH的试管中,置于沸水浴中加热20分钟,取出后冷却,将管中内溶物全部转移到100ml容量瓶中(用蒸馏水多次洗涤试管,一并收入容量瓶)加蒸馏水定容。
2、取干燥试管三支,注明空白管、标准管、测定管,按下表进行操作。加毕,摇匀,置沸水浴中10分钟,冷却,以空白管调节零点,在620nm波长下比色测定。
;五、结果计算
100g肝组织中所含糖原的克数
=(OD测/OD标)×C标×2×100×(1/1000)× (100/111)× (100/0.5)
注:100/111是此法测的葡萄糖含量换算为糖原含量的常数,即100g糖原用蒽酮试剂显色相当于111g葡萄糖用蒽酮试剂所显得色
;实验五 双缩脲法测定蛋白质的浓度;;三、实验试剂
1、1mg/ml卵清蛋白液:将1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml.
2、双缩脲试剂:将1.75gCuSO4.5H2O溶于约150ml蒸馏水,然后置于1000ml容量瓶中,加入300ml浓氨水、300ml冰冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液,摇匀,室温放置2小时,再加蒸馏水至刻度,摇匀备用。
;四、实验步骤
1、标准曲线的绘制:取7支干燥的试管,按下表加入试剂:
将上述溶液混合后,试管中即有紫红色出现,在540nm下测的各管的吸光度,以蛋白质浓度为横坐标,OD值为纵坐标作出标准曲线。
2、 样液的测定
取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml置试管中,加入双缩脲试剂2.0ml,混匀,测其540nm的吸光度,对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。;实验六 氨基酸的纸层析法;二、实验仪器
1、?新华滤纸
2、?层析缸
3、?细线
4、?点样管
5、?橡皮筋
6、?电吹风
7、?喷雾器
;;四、
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